【正文】 的相關(guān)研究。這種方法需要設(shè)計(jì)多一倍的靶向sgRNAs，雖然會(huì)減少脫靶率，但是多個(gè)sgRNAs 也可能引起復(fù)雜的組合型DNA 片段編輯。宿主微環(huán)境適應(yīng)：（(1)念珠菌為什么要進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換？ (2)念珠菌為什么能進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換 (尤其是共生或感染過(guò)程中) ？）宿主環(huán)境特征：復(fù)雜和易變 相對(duì)高溫（37 186。1. 限制有性生殖，white細(xì)胞中完全關(guān)閉交 配相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。意義：（1）在兩種形態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)之間建立了聯(lián)系；（2）暗示白念珠菌形態(tài)發(fā)生可能有更強(qiáng)的可塑性及宿主環(huán)境適應(yīng)能力。獨(dú)特的生物學(xué)特征超強(qiáng)的宿主環(huán)境適應(yīng)能力：形態(tài)轉(zhuǎn)換、有性生殖、毒性因子、生物被膜、宿主微環(huán)境適應(yīng)、念珠菌宿主互作、藥物及耐藥、基因組及基因組穩(wěn)定性l 因此，我們可以不殺死真菌，而只是抑制其菌絲的生長(zhǎng)來(lái)削弱其侵染人體的能力，同時(shí)能夠避免真菌產(chǎn)生抗藥性。Mac1也可以調(diào)控白念珠菌細(xì)胞死亡。 這部分內(nèi)容我覺(jué)得對(duì)我?guī)椭畲蟮膽?yīng)該是大腸桿菌，它是一種生物技術(shù)載體，幾乎每個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都在使用的一種細(xì)菌，包括我們實(shí)驗(yàn)室。并且為我們提供了一些預(yù)防和治療真菌的可能的途徑，有待于我們來(lái)思考。 大腸桿菌,芽孢桿菌,乳酸菌方面，鐘老師為我們講授了模式生物的遺傳與分子生物學(xué)技術(shù)。我們可以利用這項(xiàng)法則來(lái)治療和預(yù)防真菌疾病。 有超強(qiáng)的適應(yīng)宿主微環(huán)境的能力！怎樣預(yù)防和治療白色念珠菌和其他真菌引起的疾??？l 通過(guò)認(rèn)識(shí)白色念珠菌的生物學(xué)特征，減少感染機(jī)會(huì)；有超強(qiáng)的適應(yīng)宿主微環(huán)境的能力：高溫環(huán)境適應(yīng)（≥37176。灰菌菌絲細(xì)胞能進(jìn)行高效率交配。White cells 可以促進(jìn) opaque cells交配。WOR1是調(diào)控Whiteopaque轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵基因。同時(shí)相對(duì)于普通質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，作用是時(shí)間也比較長(zhǎng)，可以達(dá)到更理想的敲除效果。在不同的染色體上引入同時(shí)出現(xiàn)的DSBs 是引發(fā)染色體易位必不可少的環(huán)節(jié)之一。DNA 片段靶向反轉(zhuǎn)：吳強(qiáng)團(tuán)隊(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠中對(duì)DNA 片段反轉(zhuǎn)進(jìn)行了詳盡的研究。））l CRISPRCas9技術(shù)應(yīng)用策略特點(diǎn)： 1)以RNADNA配對(duì)為基礎(chǔ)，可在多位點(diǎn)同時(shí)編輯 2)通過(guò)對(duì)Cas9活性修飾，可以拓展適用范圍。l 在一定程度上為回答CRISPR適應(yīng)過(guò)程如何區(qū)分異己DNA提供了線索。Cas3然后會(huì)在任意方向沿著DNA作為spacer獲得復(fù)合體的一部分。 嗜熱古菌研究意義：嗜熱古菌的研究對(duì)生命科學(xué)的貢獻(xiàn) ：嗜熱古菌具有特殊的機(jī)制（如正超螺旋）穩(wěn)定其基因組；同時(shí)具有熱穩(wěn)定蛋白，因此是耐熱蛋白和工具酶的很好的來(lái)源，如應(yīng)用于PCR的Pfu酶。 l 高溫古菌：易于生化分析，但平板培養(yǎng)及遺傳操作較困難，還需研發(fā)合適的抗生素標(biāo)記等。生物信息分析表明, 地中海富鹽菌編碼8種β酮硫解酶同源蛋白；但單獨(dú)基因敲除后仍能合成PHA；推測(cè)存在功能冗余、PhaA和BktB由不同基因編碼。以古菌的基因組復(fù)制為例：1　 所需的元件：復(fù)制模板、引物、DNA聚合酶、解鏈酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA連接酶拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA連接酶2　 復(fù)制過(guò)程中各元件的配合過(guò)程：起始：復(fù)制起點(diǎn)的識(shí)別，解旋酶加載，解鏈；延伸：?jiǎn)捂淒NA被單鏈結(jié)合蛋白保護(hù)，引發(fā)物合成引物，引物通過(guò)DNA聚合酶延伸前導(dǎo)鏈后隨練合成岡崎片段，滑夾裝載蛋白R(shí)FC通過(guò)與引發(fā)物合物及PCNA的互作協(xié)調(diào)DNA聚合酶在后隨鏈上的重復(fù)裝載及鏈延伸；Fen1以及l(fā)igase完成引物處理以及岡崎片段連接。l 啟動(dòng)子核心序列：TATA box (中心通常位于－25)，結(jié)合TBP, 富含AT；決定啟動(dòng)子活性BRE元件 (緊臨TATA box上游)，結(jié)合TFB, 富含嘌呤；決定轉(zhuǎn)錄方向l 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子: TATAbox binding protein (TBP)Transcription Factor B (TFB, 與真核?生物物TFIIB類(lèi)似）l RNA聚合酶(RNAP): 真核類(lèi)型，有1113個(gè)亞基古菌RNAP與真核生物類(lèi)似，與細(xì)菌很不一樣： DLNP提供平臺(tái)以結(jié)合Ａ’A”B’B”形成活性位點(diǎn)；K對(duì)上述活性有增強(qiáng)作用(K可與TFB互作，但并非必不可少）；H增加對(duì)啟動(dòng)子的特異活性；EF為RNAP結(jié)構(gòu)組成，但非活性必須。而此次的最新研究確認(rèn)其形成與含鹽的液態(tài)水體流動(dòng)有關(guān)。它們能在無(wú)氧、無(wú)陽(yáng)光的條件下生存，借助化學(xué)反應(yīng)的能量或地?zé)岬刃玛惔x，甲烷是其代謝產(chǎn)物。地球最初形成時(shí)并不存在氧氣，看起來(lái)也是一片荒涼的不毛之地。如果真的存在，可能會(huì)是什么類(lèi)型的極端微生物？ l ℃，℃，℃。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)及核酸研究技術(shù)的不斷完善，16S rRNA基因檢測(cè)技術(shù)已成為病原菌檢測(cè)和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。l 339。 l 基因組中有很多插入序列 ：乳酸菌基因組中中含有轉(zhuǎn)座因子插入序列(IS)，大小一般在7502500bp，%到乳酸乳球菌乳脂亞種的5%，說(shuō)明這些菌有較高的遺傳可塑性。隨著測(cè)序速度的加快和成本的降低，以及分析軟件的發(fā)展，MLST逐漸成為細(xì)菌的常規(guī)分型方法。 l ROS(reactive oxygen species)是微生物在有氧代謝中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，過(guò)量的ROS會(huì)導(dǎo)致氧脅迫和細(xì)胞損傷。 雙組份調(diào)控中的應(yīng)答調(diào)控蛋白 ：這些雙組份系統(tǒng)在感受傳遞外界信號(hào)、調(diào)控 細(xì)胞生理活動(dòng)過(guò)程中具重要作用 其它調(diào)控基因 ：主要包括：DnaA, CspA, IHF , PhoU, WhiA, LytR以及PyrR 家族，這些蛋白高度保守，如 PyrR在多種細(xì)菌中通過(guò)與靶基因mRNA上特異 性序列的結(jié)合調(diào)控嘧啶核苷酸合成基因的表達(dá)。 （也就是說(shuō)谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征 ：α酮戊二酸氧化能力微弱:；α酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低；谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)；還原性輔酶Ⅱ(NADPH+H+)進(jìn)入呼吸鏈能力缺陷或微弱；異檸檬酸裂解酶活力微弱；不利用谷氨酸；耐高糖耐高谷氨酸 ；CO2固定能力強(qiáng)； 解除谷氨酸反饋抑制；具有向胞外分泌谷氨酸的能力.） 基因組信息：谷氨酸棒桿菌的碳代謝及氨基酸合成系統(tǒng)構(gòu)建 ：l 糖吸收 ：PTS系統(tǒng)：葡萄糖、果糖、甘露糖以及蔗糖 果糖攝取的PTS系統(tǒng)相關(guān)基因： ptsIcg2118pfkBptsFptsH 葡萄糖、甘露糖、蔗糖相關(guān)基因：ptsG、ptsM、ptsSl 碳源的中心代謝系統(tǒng) ：l 基因成簇：如：gappgktpippc, aceAaceB 或 sdhCsdhAsdhB l 含多種同工酶 l 含有功能未知酶：如：cg0441和cg0790（假設(shè)的硫鋅酰胺脫氫酶，cg0949和cg0798（檸檬酸鹽合成酶） 生物合成及轉(zhuǎn)運(yùn)代謝系統(tǒng)的重建 對(duì)于利用天冬氨酸鹽或丙酮酸鹽過(guò)量生產(chǎn)L氨基酸和維生素具有重要作用 。若溫度過(guò)高,菌體易衰老, 生產(chǎn)中表現(xiàn)為O D值增長(zhǎng)慢, 耗糖慢, pH值高, 最終發(fā)酵周期長(zhǎng),產(chǎn)酸少。l NH4+濃度： 影響到發(fā)酵液的pH值 與產(chǎn)物的形成有關(guān)：NH4+過(guò)量，菌體增殖階段會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)酸階段 Glu會(huì)受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（ Gln） NH4+不足，不利于α KGA的還原氨基化， α酮戊二酸積累，引起反饋調(diào) 節(jié)。 l 谷氨酸產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH氧化能力欠缺或喪失：NADPH是αKGA還原氨基化生成谷氨酸的必須物質(zhì)，該還原氨基化所需要的NADPH與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián)。Vip與Sip毒素都顯示了對(duì)一些鞘翅目昆蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性。前體蛋白可以通過(guò)Tat蛋白復(fù)合物(Tat易位酶)組成的通道而穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜； 216。 B. subtilis中最主要的蛋白質(zhì)分泌途徑，可以分為3個(gè)功能階段：①蛋白定位：分泌蛋白首先由核糖體合成前體，前體蛋白在N端含有信號(hào)肽；細(xì)胞質(zhì)分子伴侶可以幫助前體蛋白保持能夠被遷移的狀態(tài)； SRP與信號(hào)肽相互識(shí)別，將前體定位于膜上的Sec易位酶復(fù)合物。這個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)稱(chēng)為NICE系統(tǒng)。1 簡(jiǎn)述納豆激酶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路。 感受態(tài)的形成主要包括三個(gè)過(guò)程：群感效應(yīng)系統(tǒng)，主要調(diào)控子ComK的激活，ComK激活下游感受態(tài)相關(guān)基因。3) 質(zhì)粒大小變化也很大，從2kb到大于600kb，且不同菌株的質(zhì)粒譜型并不總與其系統(tǒng)發(fā)育相匹配。Bacillus cereus group均為能夠形成孢子的菌株，基因及基因組序列數(shù)據(jù)顯示其種間密切相關(guān)，即染色體具有很高的的相似性和共線性，甚至被認(rèn)為屬于相同的種，其包含6個(gè)不同的種：1) B. cereus sensu stricto: 狹義的蠟狀芽孢桿菌，廣泛存在于土壤中，能引起食品污染，導(dǎo)致人類(lèi)嘔吐和腹瀉，并且有些菌株能引起軟組織感染的機(jī)會(huì)致病菌。與低相對(duì)分子量的生物有機(jī)化合物相比，生物大分子具有更高級(jí)的物質(zhì)群。 細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征：細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有成形的細(xì)胞核；含有質(zhì)粒；基因組或質(zhì)粒上含有“致病島” 它是一段特殊的DNA片段，包含毒素分泌系統(tǒng)，粘附素等，能夠在菌株和相近種之間轉(zhuǎn)移?？股鼗蛐》肿优c抑制子結(jié)合，減弱其與靶標(biāo)DNA的結(jié)合，從而解除其對(duì)激活子抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)下游外排泵的高表達(dá)。下游模塊：改變GGPS和TS兩個(gè)合成基因的順序；通過(guò)啟動(dòng)子更換以及改造，協(xié)調(diào)基因的表達(dá)量；去除代謝抑制子indole。藥物研發(fā)策略：生產(chǎn)某種物質(zhì)，綜合策略： 拓展底物利用能力和范圍（“進(jìn)”） 加快產(chǎn)物轉(zhuǎn)到胞外（“出”） 加強(qiáng)目標(biāo)合成酶活性（“加”） 減少分支合成途徑（“減”） 引入新的合成途徑，或延伸已有途徑（“增”） 改善細(xì)胞的耐受性定向遺傳修飾利用大腸桿菌合成相關(guān)藥物：A、 大腸桿菌產(chǎn)生蛋白類(lèi)藥物 ：優(yōu)先選用的蛋白藥物表達(dá)宿主，即利用上述的策略來(lái)進(jìn)行定向遺傳改造而合成蛋白類(lèi)藥物。此外，對(duì)轉(zhuǎn)錄單元中啟動(dòng)子的替換和定向改造也是隱性次級(jí)代謝基因簇激活的有效方法。 有哪些方法或策略可以得到新型抗生素?1. 更多鏈霉菌基因組的測(cè)序及挖掘：隨著更多鏈霉菌基因組的不斷完成和信息積累, 為抗生素生物合成基因簇的研究，發(fā)現(xiàn)新型抗生素提供了重要的條件。 鏈霉菌信號(hào)分子有哪幾種類(lèi)型, GBL類(lèi)型的信號(hào)分子在抗生素生物合成中如何發(fā)揮其功能? 菌群群體反應(yīng)感應(yīng)信號(hào)分子當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到閾值啟動(dòng)特定基因表達(dá)改變和協(xié)調(diào)細(xì)胞間行為使群體呈現(xiàn)某種生理特征。大多數(shù)SARP蛋白都是途徑特異性調(diào)控子，一般只調(diào)控與其相鄰的基因。鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)其本身的意義：當(dāng)鏈霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中感受到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制或者其它壓力時(shí)，伴隨著由基質(zhì)菌絲形成氣生菌絲，菌體周?chē)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，鏈霉菌開(kāi)始降解自身的基質(zhì)菌絲為形成繁殖型的氣生菌絲提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)各種次級(jí)代謝產(chǎn)物（抗生素）開(kāi)始產(chǎn)生，而次級(jí)代謝產(chǎn)物可以幫助鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫，從而創(chuàng)造利于自身生活的環(huán)境。進(jìn)行生殖生長(zhǎng)產(chǎn)生氣生菌絲和孢子，成熟孢子隨風(fēng)或其他生物帶到更加適宜其生活的環(huán)境中，對(duì)于鏈霉菌自身是十分重要的生活方式，使之區(qū)別物其他的原核生物，所以這種發(fā)育分化過(guò)程對(duì)于鏈霉菌自身意義重大。我們平時(shí)多采用基本的遺傳操作，構(gòu)建敲除質(zhì)粒載體，然后導(dǎo)入受體菌株進(jìn)行同源重組進(jìn)行單交換，利用抗生素進(jìn)行篩選，隨后還需要進(jìn)行雙交換。l CRISPRCas9介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)：首先優(yōu)化cas9的密碼子，將其放置在強(qiáng)啟動(dòng)子之后并克隆到敲除質(zhì)粒上，敲除質(zhì)粒上含有sgRNA并置于組成型啟動(dòng)子之后， sgRNA中的引導(dǎo)序列為靶位點(diǎn)的同源序列，敲除質(zhì)粒必須包括靶基因兩側(cè)的同源臂。 無(wú)數(shù)事實(shí)說(shuō)明了一個(gè)真理，即宇宙間的所有物種變是絕對(duì)的，不變則是相對(duì)的。 微生物基因突變一般分幾種類(lèi)型,突變有什么生物學(xué)意義?（譚老師）基因突變可從突變發(fā)生方式和突變引起的表型改變和遺傳物質(zhì)改變等方面進(jìn)行分類(lèi)。當(dāng)染色體上發(fā)生缺失時(shí)可用Δ表示（如ΔtrpA或ΔtrpA）；基因突變：如亮氨酸缺陷型leu；抗藥性基因：r表示抗性，加s表示敏感如鏈霉素抗性基因表示為strr，敏感基因表示為strs。最終，物種的面貌特征與祖先不同，所以說(shuō)，突變是生物進(jìn)化的內(nèi)因，是進(jìn)化的主要?jiǎng)恿ΑＨ绻l(fā)生同源雙交換， sceS被刪除，即使誘導(dǎo)表達(dá)SecI也不會(huì)造成基因組DNA的斷裂，菌體仍然存活，并表現(xiàn)出抗性敏感。在今后的實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)用到： 我們實(shí)驗(yàn)室是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，這些技術(shù)方法對(duì)于我今后的研究室有助益的。這種分化過(guò)程可以賦予鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫的能力。 這常常與活性營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和抱子形成之間的轉(zhuǎn)變相一致。途徑特異性調(diào)控蛋白如SARP蛋白，SARP蛋白都含有OmpR類(lèi)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，通過(guò)招募RNA聚合酶到靶基因的啟動(dòng)子上游激活基因的轉(zhuǎn)錄。l 抗生素作為終產(chǎn)物介導(dǎo)的自調(diào)控系統(tǒng)可取代雙組分系統(tǒng)中通過(guò)磷酸化作用的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制，并證明這種新調(diào)控機(jī)制在微生物次級(jí)代謝生物合成中是廣泛存在的。翻譯后的AdpA控制鏈霉素生物合成基因簇中調(diào)控基因strR的轉(zhuǎn)錄, StrR激活strB1開(kāi)始的這個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的基因轉(zhuǎn)錄, 從而調(diào)控鏈霉素的生物合成。3. 調(diào)控子的遺傳操作：隱性次級(jí)代謝基因簇在受阻遏和缺乏激活因子的情況下不能得到表達(dá)，去除負(fù)調(diào)控基因的阻遏和構(gòu)建正調(diào)控基因的有效表達(dá)是激活隱性次級(jí)代謝基因簇表達(dá)的策略之一。第四章 大腸桿菌 芽孢桿菌 棒桿菌 乳酸菌 結(jié)合大腸桿菌（致病和非致?。┑募?xì)胞結(jié)構(gòu)特征及其生物大分子的生物合成規(guī)律，簡(jiǎn)述若干種藥物研發(fā)的策略。因此，上游模塊：增加整個(gè)MEP途徑的拷貝數(shù)；在染色體中引入T7 RNA 聚合酶，并在限速酶前引入T7啟動(dòng)子；通過(guò)不同質(zhì)粒的引入和改變啟動(dòng)子強(qiáng)度來(lái)協(xié)調(diào)不同基因的拷貝數(shù)以及表達(dá)量；將合成酶基因整合到染色體上，減小代謝負(fù)擔(dān)。作用于致病大腸桿菌的藥物的研發(fā)：D、外排泵的抑制子作為潛在的藥物靶標(biāo)：TetR類(lèi)抑制子控制本底水平的外排泵AcrA和AcrB的表達(dá)； AraC類(lèi)的激活子能解除TetR的抑制，使外排泵大量表達(dá)； MarR類(lèi)的抑制子能夠抑制AraC的轉(zhuǎn)錄，間接影響外排泵表達(dá)。E、抗生素作用的靶標(biāo)或抗性菌株突變的位點(diǎn)：例如，萬(wàn)古霉素作用位點(diǎn)為雙丙氨酰，抑制細(xì)胞壁的