【正文】 的相關研究。這種方法需要設計多一倍的靶向sgRNAs，雖然會減少脫靶率，但是多個sgRNAs 也可能引起復雜的組合型DNA 片段編輯。宿主微環(huán)境適應：（(1)念珠菌為什么要進行形態(tài)轉(zhuǎn)換？ (2)念珠菌為什么能進行形態(tài)轉(zhuǎn)換 (尤其是共生或感染過程中) ？）宿主環(huán)境特征：復雜和易變 相對高溫（37 186。1. 限制有性生殖，white細胞中完全關閉交 配相關生物學過程。意義：（1）在兩種形態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)之間建立了聯(lián)系；（2）暗示白念珠菌形態(tài)發(fā)生可能有更強的可塑性及宿主環(huán)境適應能力。獨特的生物學特征超強的宿主環(huán)境適應能力：形態(tài)轉(zhuǎn)換、有性生殖、毒性因子、生物被膜、宿主微環(huán)境適應、念珠菌宿主互作、藥物及耐藥、基因組及基因組穩(wěn)定性l 因此，我們可以不殺死真菌，而只是抑制其菌絲的生長來削弱其侵染人體的能力，同時能夠避免真菌產(chǎn)生抗藥性。Mac1也可以調(diào)控白念珠菌細胞死亡。 這部分內(nèi)容我覺得對我?guī)椭畲蟮膽撌谴竽c桿菌，它是一種生物技術載體，幾乎每個分子生物學實驗室都在使用的一種細菌，包括我們實驗室。并且為我們提供了一些預防和治療真菌的可能的途徑，有待于我們來思考。 大腸桿菌,芽孢桿菌,乳酸菌方面，鐘老師為我們講授了模式生物的遺傳與分子生物學技術。我們可以利用這項法則來治療和預防真菌疾病。 有超強的適應宿主微環(huán)境的能力！怎樣預防和治療白色念珠菌和其他真菌引起的疾病？l 通過認識白色念珠菌的生物學特征，減少感染機會；有超強的適應宿主微環(huán)境的能力：高溫環(huán)境適應（≥37176。灰菌菌絲細胞能進行高效率交配。White cells 可以促進 opaque cells交配。WOR1是調(diào)控Whiteopaque轉(zhuǎn)換的關鍵基因。同時相對于普通質(zhì)粒來說，作用是時間也比較長，可以達到更理想的敲除效果。在不同的染色體上引入同時出現(xiàn)的DSBs 是引發(fā)染色體易位必不可少的環(huán)節(jié)之一。DNA 片段靶向反轉(zhuǎn)：吳強團隊在哺乳動物細胞和小鼠中對DNA 片段反轉(zhuǎn)進行了詳盡的研究。））l CRISPRCas9技術應用策略特點： 1)以RNADNA配對為基礎，可在多位點同時編輯 2)通過對Cas9活性修飾，可以拓展適用范圍。l 在一定程度上為回答CRISPR適應過程如何區(qū)分異己DNA提供了線索。Cas3然后會在任意方向沿著DNA作為spacer獲得復合體的一部分。 嗜熱古菌研究意義：嗜熱古菌的研究對生命科學的貢獻 ：嗜熱古菌具有特殊的機制（如正超螺旋）穩(wěn)定其基因組；同時具有熱穩(wěn)定蛋白，因此是耐熱蛋白和工具酶的很好的來源，如應用于PCR的Pfu酶。 l 高溫古菌：易于生化分析，但平板培養(yǎng)及遺傳操作較困難，還需研發(fā)合適的抗生素標記等。生物信息分析表明, 地中海富鹽菌編碼8種β酮硫解酶同源蛋白；但單獨基因敲除后仍能合成PHA；推測存在功能冗余、PhaA和BktB由不同基因編碼。以古菌的基因組復制為例：1　 所需的元件：復制模板、引物、DNA聚合酶、解鏈酶、單鏈結合蛋白、DNA連接酶拓撲異構酶、DNA連接酶2　 復制過程中各元件的配合過程：起始：復制起點的識別，解旋酶加載，解鏈；延伸：單鏈DNA被單鏈結合蛋白保護，引發(fā)物合成引物，引物通過DNA聚合酶延伸前導鏈后隨練合成岡崎片段，滑夾裝載蛋白RFC通過與引發(fā)物合物及PCNA的互作協(xié)調(diào)DNA聚合酶在后隨鏈上的重復裝載及鏈延伸；Fen1以及l(fā)igase完成引物處理以及岡崎片段連接。l 啟動子核心序列：TATA box (中心通常位于－25)，結合TBP, 富含AT；決定啟動子活性BRE元件 (緊臨TATA box上游)，結合TFB, 富含嘌呤；決定轉(zhuǎn)錄方向l 基礎轉(zhuǎn)錄因子: TATAbox binding protein (TBP)Transcription Factor B (TFB, 與真核?生物物TFIIB類似）l RNA聚合酶(RNAP): 真核類型，有1113個亞基古菌RNAP與真核生物類似，與細菌很不一樣： DLNP提供平臺以結合Ａ’A”B’B”形成活性位點；K對上述活性有增強作用(K可與TFB互作，但并非必不可少）；H增加對啟動子的特異活性；EF為RNAP結構組成，但非活性必須。而此次的最新研究確認其形成與含鹽的液態(tài)水體流動有關。它們能在無氧、無陽光的條件下生存，借助化學反應的能量或地熱等新陳代謝，甲烷是其代謝產(chǎn)物。地球最初形成時并不存在氧氣，看起來也是一片荒涼的不毛之地。如果真的存在，可能會是什么類型的極端微生物？ l ℃，℃，℃。隨著PCR技術的出現(xiàn)及核酸研究技術的不斷完善，16S rRNA基因檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。l 339。 l 基因組中有很多插入序列 ：乳酸菌基因組中中含有轉(zhuǎn)座因子插入序列(IS)，大小一般在7502500bp，%到乳酸乳球菌乳脂亞種的5%，說明這些菌有較高的遺傳可塑性。隨著測序速度的加快和成本的降低，以及分析軟件的發(fā)展，MLST逐漸成為細菌的常規(guī)分型方法。 l ROS(reactive oxygen species)是微生物在有氧代謝中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，過量的ROS會導致氧脅迫和細胞損傷。 雙組份調(diào)控中的應答調(diào)控蛋白 ：這些雙組份系統(tǒng)在感受傳遞外界信號、調(diào)控 細胞生理活動過程中具重要作用 其它調(diào)控基因 ：主要包括：DnaA, CspA, IHF , PhoU, WhiA, LytR以及PyrR 家族，這些蛋白高度保守，如 PyrR在多種細菌中通過與靶基因mRNA上特異 性序列的結合調(diào)控嘧啶核苷酸合成基因的表達。 （也就是說谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征 ：α酮戊二酸氧化能力微弱:；α酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低；谷氨酸脫氫酶活性強；還原性輔酶Ⅱ(NADPH+H+)進入呼吸鏈能力缺陷或微弱；異檸檬酸裂解酶活力微弱；不利用谷氨酸；耐高糖耐高谷氨酸 ；CO2固定能力強； 解除谷氨酸反饋抑制；具有向胞外分泌谷氨酸的能力.） 基因組信息：谷氨酸棒桿菌的碳代謝及氨基酸合成系統(tǒng)構建 ：l 糖吸收 ：PTS系統(tǒng)：葡萄糖、果糖、甘露糖以及蔗糖 果糖攝取的PTS系統(tǒng)相關基因： ptsIcg2118pfkBptsFptsH 葡萄糖、甘露糖、蔗糖相關基因：ptsG、ptsM、ptsSl 碳源的中心代謝系統(tǒng) ：l 基因成簇：如：gappgktpippc, aceAaceB 或 sdhCsdhAsdhB l 含多種同工酶 l 含有功能未知酶：如：cg0441和cg0790（假設的硫鋅酰胺脫氫酶，cg0949和cg0798（檸檬酸鹽合成酶） 生物合成及轉(zhuǎn)運代謝系統(tǒng)的重建 對于利用天冬氨酸鹽或丙酮酸鹽過量生產(chǎn)L氨基酸和維生素具有重要作用 。若溫度過高,菌體易衰老, 生產(chǎn)中表現(xiàn)為O D值增長慢, 耗糖慢, pH值高, 最終發(fā)酵周期長,產(chǎn)酸少。l NH4+濃度： 影響到發(fā)酵液的pH值 與產(chǎn)物的形成有關：NH4+過量，菌體增殖階段會抑制菌體生長，產(chǎn)酸階段 Glu會受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（ Gln） NH4+不足，不利于α KGA的還原氨基化， α酮戊二酸積累，引起反饋調(diào) 節(jié)。 l 谷氨酸產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH氧化能力欠缺或喪失：NADPH是αKGA還原氨基化生成谷氨酸的必須物質(zhì)，該還原氨基化所需要的NADPH與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián)。Vip與Sip毒素都顯示了對一些鞘翅目昆蟲的殺蟲活性。前體蛋白可以通過Tat蛋白復合物(Tat易位酶)組成的通道而穿過細胞質(zhì)膜； 216。 B. subtilis中最主要的蛋白質(zhì)分泌途徑，可以分為3個功能階段：①蛋白定位：分泌蛋白首先由核糖體合成前體，前體蛋白在N端含有信號肽；細胞質(zhì)分子伴侶可以幫助前體蛋白保持能夠被遷移的狀態(tài)； SRP與信號肽相互識別，將前體定位于膜上的Sec易位酶復合物。這個誘導表達系統(tǒng)稱為NICE系統(tǒng)。1 簡述納豆激酶產(chǎn)品開發(fā)的實驗設計思路。 感受態(tài)的形成主要包括三個過程：群感效應系統(tǒng)，主要調(diào)控子ComK的激活，ComK激活下游感受態(tài)相關基因。3) 質(zhì)粒大小變化也很大，從2kb到大于600kb，且不同菌株的質(zhì)粒譜型并不總與其系統(tǒng)發(fā)育相匹配。Bacillus cereus group均為能夠形成孢子的菌株，基因及基因組序列數(shù)據(jù)顯示其種間密切相關，即染色體具有很高的的相似性和共線性，甚至被認為屬于相同的種，其包含6個不同的種：1) B. cereus sensu stricto: 狹義的蠟狀芽孢桿菌，廣泛存在于土壤中，能引起食品污染，導致人類嘔吐和腹瀉，并且有些菌株能引起軟組織感染的機會致病菌。與低相對分子量的生物有機化合物相比，生物大分子具有更高級的物質(zhì)群。 細胞結構特征：細胞內(nèi)沒有成形的細胞核；含有質(zhì)粒；基因組或質(zhì)粒上含有“致病島” 它是一段特殊的DNA片段，包含毒素分泌系統(tǒng)，粘附素等，能夠在菌株和相近種之間轉(zhuǎn)移?？股鼗蛐》肿优c抑制子結合，減弱其與靶標DNA的結合，從而解除其對激活子抑制作用，進而促進下游外排泵的高表達。下游模塊：改變GGPS和TS兩個合成基因的順序；通過啟動子更換以及改造，協(xié)調(diào)基因的表達量；去除代謝抑制子indole。藥物研發(fā)策略：生產(chǎn)某種物質(zhì)，綜合策略： 拓展底物利用能力和范圍（“進”） 加快產(chǎn)物轉(zhuǎn)到胞外（“出”） 加強目標合成酶活性（“加”） 減少分支合成途徑（“減”） 引入新的合成途徑，或延伸已有途徑（“增”） 改善細胞的耐受性定向遺傳修飾利用大腸桿菌合成相關藥物：A、 大腸桿菌產(chǎn)生蛋白類藥物 ：優(yōu)先選用的蛋白藥物表達宿主，即利用上述的策略來進行定向遺傳改造而合成蛋白類藥物。此外，對轉(zhuǎn)錄單元中啟動子的替換和定向改造也是隱性次級代謝基因簇激活的有效方法。 有哪些方法或策略可以得到新型抗生素?1. 更多鏈霉菌基因組的測序及挖掘：隨著更多鏈霉菌基因組的不斷完成和信息積累, 為抗生素生物合成基因簇的研究，發(fā)現(xiàn)新型抗生素提供了重要的條件。 鏈霉菌信號分子有哪幾種類型, GBL類型的信號分子在抗生素生物合成中如何發(fā)揮其功能? 菌群群體反應感應信號分子當信號分子達到閾值啟動特定基因表達改變和協(xié)調(diào)細胞間行為使群體呈現(xiàn)某種生理特征。大多數(shù)SARP蛋白都是途徑特異性調(diào)控子，一般只調(diào)控與其相鄰的基因。鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對其本身的意義：當鏈霉菌在生長過程中感受到環(huán)境中的營養(yǎng)限制或者其它壓力時，伴隨著由基質(zhì)菌絲形成氣生菌絲，菌體周圍的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，鏈霉菌開始降解自身的基質(zhì)菌絲為形成繁殖型的氣生菌絲提供營養(yǎng)，同時各種次級代謝產(chǎn)物（抗生素）開始產(chǎn)生，而次級代謝產(chǎn)物可以幫助鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫，從而創(chuàng)造利于自身生活的環(huán)境。進行生殖生長產(chǎn)生氣生菌絲和孢子，成熟孢子隨風或其他生物帶到更加適宜其生活的環(huán)境中，對于鏈霉菌自身是十分重要的生活方式，使之區(qū)別物其他的原核生物，所以這種發(fā)育分化過程對于鏈霉菌自身意義重大。我們平時多采用基本的遺傳操作，構建敲除質(zhì)粒載體，然后導入受體菌株進行同源重組進行單交換，利用抗生素進行篩選，隨后還需要進行雙交換。l CRISPRCas9介導的同源重組系統(tǒng)：首先優(yōu)化cas9的密碼子，將其放置在強啟動子之后并克隆到敲除質(zhì)粒上，敲除質(zhì)粒上含有sgRNA并置于組成型啟動子之后， sgRNA中的引導序列為靶位點的同源序列，敲除質(zhì)粒必須包括靶基因兩側(cè)的同源臂。 無數(shù)事實說明了一個真理，即宇宙間的所有物種變是絕對的，不變則是相對的。 微生物基因突變一般分幾種類型,突變有什么生物學意義?（譚老師）基因突變可從突變發(fā)生方式和突變引起的表型改變和遺傳物質(zhì)改變等方面進行分類。當染色體上發(fā)生缺失時可用Δ表示（如ΔtrpA或ΔtrpA）；基因突變：如亮氨酸缺陷型leu；抗藥性基因：r表示抗性，加s表示敏感如鏈霉素抗性基因表示為strr，敏感基因表示為strs。最終，物種的面貌特征與祖先不同，所以說，突變是生物進化的內(nèi)因，是進化的主要動力。如果發(fā)生同源雙交換， sceS被刪除，即使誘導表達SecI也不會造成基因組DNA的斷裂，菌體仍然存活，并表現(xiàn)出抗性敏感。在今后的實驗中可能會用到： 我們實驗室是分子生物學實驗室，這些技術方法對于我今后的研究室有助益的。這種分化過程可以賦予鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫的能力。 這常常與活性營養(yǎng)生長和抱子形成之間的轉(zhuǎn)變相一致。途徑特異性調(diào)控蛋白如SARP蛋白，SARP蛋白都含有OmpR類的DNA結合結構域和轉(zhuǎn)錄激活結構域，通過招募RNA聚合酶到靶基因的啟動子上游激活基因的轉(zhuǎn)錄。l 抗生素作為終產(chǎn)物介導的自調(diào)控系統(tǒng)可取代雙組分系統(tǒng)中通過磷酸化作用的應答調(diào)控機制，并證明這種新調(diào)控機制在微生物次級代謝生物合成中是廣泛存在的。翻譯后的AdpA控制鏈霉素生物合成基因簇中調(diào)控基因strR的轉(zhuǎn)錄, StrR激活strB1開始的這個轉(zhuǎn)錄單元的基因轉(zhuǎn)錄, 從而調(diào)控鏈霉素的生物合成。3. 調(diào)控子的遺傳操作：隱性次級代謝基因簇在受阻遏和缺乏激活因子的情況下不能得到表達，去除負調(diào)控基因的阻遏和構建正調(diào)控基因的有效表達是激活隱性次級代謝基因簇表達的策略之一。第四章 大腸桿菌 芽孢桿菌 棒桿菌 乳酸菌 結合大腸桿菌（致病和非致?。┑募毎Y構特征及其生物大分子的生物合成規(guī)律，簡述若干種藥物研發(fā)的策略。因此，上游模塊：增加整個MEP途徑的拷貝數(shù)；在染色體中引入T7 RNA 聚合酶，并在限速酶前引入T7啟動子；通過不同質(zhì)粒的引入和改變啟動子強度來協(xié)調(diào)不同基因的拷貝數(shù)以及表達量；將合成酶基因整合到染色體上，減小代謝負擔。作用于致病大腸桿菌的藥物的研發(fā)：D、外排泵的抑制子作為潛在的藥物靶標：TetR類抑制子控制本底水平的外排泵AcrA和AcrB的表達； AraC類的激活子能解除TetR的抑制，使外排泵大量表達； MarR類的抑制子能夠抑制AraC的轉(zhuǎn)錄，間接影響外排泵表達。E、抗生素作用的靶標或抗性菌株突變的位點：例如，萬古霉素作用位點為雙丙氨酰，抑制細胞壁的