【正文】 重點介紹各類細菌突出的分子遺傳特點和最新研究進展，同時也講述各類細菌在工農(nóng)業(yè)及食品保健等領(lǐng)域的應(yīng)用，使我們對細菌分子遺傳研究有了較全面認識。C）；能侵染人體組織；利用和吸收人體組織來源的養(yǎng)分；逃避和抵抗免疫系統(tǒng)的攻擊。不同形態(tài)細胞通過信息素進行細胞間交流，White細胞提高了整體信息素濃度從而促進opaque cells交配。Cas9 存在一定的脫靶效應(yīng)：Ran 等在小鼠受精卵中通過4 個靶向sgRNAs 在Cas9 切口酶作用下實現(xiàn)DNA 片段的刪除，他們在DYRK1A 位點處成功地嘗試了500~6000 bp DNA 片段的刪除。他們在哺乳動物細胞中對709 bp~1 Mb 的7 個不同長度的DNA 片段進行了有效地反轉(zhuǎn)(圖1B)；同時他們將Cas9 mRNA 和兩個靶向sgRNAs 注射到小鼠受精卵中，再將被注射后存活的受精卵移植到假孕鼠中獲得后代，篩選得到了反轉(zhuǎn)的嵌合小鼠，對960 bp~30kb 的不同長度的3 個DNA 片段進行了反轉(zhuǎn)，并且獲得了反轉(zhuǎn)事件的嵌合小鼠并實現(xiàn)DNA 片段反轉(zhuǎn)的種系傳代，成功獲得了F1 代反轉(zhuǎn)小鼠。 干擾與適應(yīng)的異己識別工作的意義：l 建立并統(tǒng)一了CRISPR適應(yīng)與干擾過程的異己識別模型。 2 理解引發(fā)適應(yīng)在CRISPR系統(tǒng)對抗病毒逃逸方面的重要意義和機制。 通過組合基因敲除互補發(fā)現(xiàn)PHBV特異的β酮硫解酶 。l 首先由基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TBP識別TATA box (AT rich,25~30) (中溫古菌中，其TBP甚至可被真菌或人的TBP替換）；接著上述復(fù)合物被另一種基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因TFB結(jié)合于BRE區(qū)（位于TATA box上游），從而確定轉(zhuǎn)錄方向并通過招募RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄；RNA聚合酶覆蓋從TATAbox到+18的區(qū)域，解鏈并從+1開始轉(zhuǎn)錄；其它轉(zhuǎn)錄因子如TFE也參與某些基因的轉(zhuǎn)錄（可能對RNAP招募及DNA解鏈有促進作用）。根據(jù)地球的經(jīng)驗，只要有液態(tài)水并且有一定的熱量，幾乎肯定可以有生命存活，因此推測，火星的液態(tài)水中很有可能含有甲烷古菌。相比之下，℃左右。末端包含反向的SD序列，用來與mRNA的AUG起始密碼子結(jié)合。多位點序列分型技術(shù)在乳酸菌中的應(yīng)用：通過比較ST可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性，即密切相關(guān)菌株具有相同的ST或僅有極個別基因位點不同的ST，而不相關(guān)菌株的ST至少有3個或3個以上基因位點不同。 σ因子 ：主要包括：其中SigH在熱和氧的壓力調(diào)控中具有重要作用，它調(diào) 控SigB、WhcE、HspR、ClgR 等基因的表達以及伴侶蛋白的水解 l 轉(zhuǎn)錄調(diào)控實例：全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子GlxR GlxR: cAMP感應(yīng)蛋白 ；CrpFnr 超家族 ；雙調(diào)節(jié)子 ；調(diào)控150個基因 ；所有棒桿菌中保守 。 發(fā)酵中、后期菌體生長基本停止, 為積累大量谷氨酸, 應(yīng)適當提高發(fā)酵溫度,但溫度過高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。 由于NADPH的氧化能力欠缺或喪失，使得體內(nèi)的NADPH有一定積累，NADPH對于抑制αKGA的脫羧氧化有一定的意義。在轉(zhuǎn)運的過程中，經(jīng)過信號肽酶和細胞壁通道的加工，折疊的成熟蛋白分泌至培養(yǎng)基中。此系統(tǒng)可嚴謹控制、高效表達，是很成熟的乳酸菌外源基因表達系統(tǒng)。在B. subtilis感受態(tài)形成過程中DNA結(jié)合、攝取及重組相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄都是受到感受態(tài)調(diào)控子ComK的調(diào)控，ComK直接或間接調(diào)控的基因多達100個。2) B. anthracis: 可引起炭疽熱，被用于生物武器； 3) B. thuringiensis: 能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白，被用作重要的微生物殺蟲劑； 4) B. mycoides: 腐生細菌，能夠形成根狀菌落； 5) B. pseudomycoides與B. weihenstephanensis: 放射狀的菌落形態(tài)，脂肪酸的組成與群中其他菌不同； 6) B. cytotoxicus: 最新從蠟狀芽孢桿菌中分離出來，主要與食物中毒有關(guān)，在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上與蠟狀芽孢桿菌群里其他成員較遠。大腸桿菌大部分是無害的，與宿主互利共生。多位點協(xié)調(diào)上下游兩個模塊，使前體生物大分子taxadiene的產(chǎn)量提高了約15000倍， g/L 。4. 基因簇的異源表達：為了消除菌株本身的一些限制因素，進行隱性次級代謝基因簇的異源表達也是值得嘗試的方法。鏈霉菌信號分子的類型：高絲氨酸內(nèi)酯(HSL)、自誘導(dǎo)肽(AIP)、AIγ丁酸內(nèi)酯(GBL)、DSF、PQS、法尼醇等。這對于鏈霉菌專一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具有重要的意義。我們可以考慮使用基因編輯技術(shù)來進行遺傳操做。 應(yīng)用于鏈霉菌基因組編輯與大片段DNA克隆的技術(shù)都有哪些？能否用在你們今后的實驗中？（劉鋼老師） 基因組編輯是指在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術(shù)。第1章 概論基因的符號：每個基因：如色氨酸基因trp；同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。通過誘導(dǎo)表達SecI，SecI在18個堿基的位點（sceS）切斷基因組DNA，菌體不能夠存活。 對其自身的意義：營養(yǎng)生長階段，基質(zhì)菌絲經(jīng)過頂端生長和分支，在感受到環(huán)境中的營養(yǎng)限制或者其他壓力后，以應(yīng)對環(huán)境脅迫，鏈霉菌通過bld基因級聯(lián)信號通路產(chǎn)生疏水分子SapB，從而賦予菌絲表面疏水特性而使其突破培養(yǎng)基表面的氣水張力進入繁殖性的氣生菌絲階段，然后又通過whi基因等的級聯(lián)信號通路控制下產(chǎn)生孢子，孢子成熟后飄落到適宜的環(huán)境中在進行上述過程生活。1. 抗生素生物合成的途徑特異性調(diào)控：鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇通常成簇排列，包括一個或多個調(diào)控基因，一般只負責調(diào)控所在基因簇基因表達的調(diào)控稱之為途徑特異性調(diào)控。當A因子（GBL）積累到閾值時，它與ArpA結(jié)合，使ArpA從adpA上解離，導(dǎo)致adpA有效地進行轉(zhuǎn)錄。7. 其他新方法和策略未來可能的突破：以鏈霉菌為模式，進一步闡明抗生素生物合成與調(diào)控機制，為提高重要抗生素的產(chǎn)量乃至激活隱基因簇，挖掘新型活性次級代謝產(chǎn)物方面做出創(chuàng)新性的研究成果 ；深入開展抗生素的組合生物合成和合成生物學的研究，突破天然產(chǎn)物合成過程中的瓶頸，獲得在結(jié)構(gòu)和功能上具有突出特點的新型活性化合物。綜合改造后生物大分子的產(chǎn)量提高了100多倍。 耐熱型：免疫原性弱，100℃, 20 min不破壞； 不耐熱型：免疫原性強， 65℃, 30 min破壞； 類脂A：內(nèi)毒素，熱穩(wěn)定（ 100℃, 1 h不破壞）。 c. B. cereus group中的質(zhì)粒：1) 是非常重要的形態(tài)因子，如B. thuringiensis的晶體毒蛋白基因與B. anthracis的炭疽毒素基因均位于質(zhì)粒元件上。 4　 ComK激活下游基因：當ComK濃度足夠高，ComK可激活DNA攝取基因（C,E,G,F)、DNA整合基因（recA，addAB）及自身基因k的表達。1 B. subtilis分泌蛋白有哪4種不同途徑，簡述每種途徑分泌蛋白過程及所分泌蛋白特點。1 Bt菌株在孢子形成期及營養(yǎng)生長期分別形成哪些不同的殺蟲毒素，簡述Cry蛋白殺蟲機制。供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于谷氨酸的產(chǎn)生，同時，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。 (3) 泡沫過多,易沖上罐頂,造成染菌。MtrAB系統(tǒng)作用：調(diào)控細胞壁的合成以及維持高滲環(huán)境下細胞內(nèi)外滲透壓的平衡。l 基因組中都含有假基因 ：所有的乳酸菌都含有假基因且數(shù)目變化很大，如在腸膜明串珠菌中20個，嗜熱鏈球菌含有200個假基因。16S rRNA基因是細菌上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細菌的基因組中。l 火星大氣層構(gòu)成：%的二氧化碳、%的氮、%的氬、%的氧。因此可能會存在熱泉，所以推測火星上可能會有極端嗜熱古菌和嗜熱酸古菌存在。l ，感知胞內(nèi)外環(huán)境的變化是極其重要的特征（大家可以就不同類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子舉例），本例中PhaR通過感應(yīng)PHA顆粒上的空間而調(diào)節(jié)對phaRP啟動子區(qū)的結(jié)合，從而同時調(diào)節(jié)PHA顆粒關(guān)鍵蛋白PhaP和自身的表達，確保了PHA顆粒的有序形成；因此在地中海富鹽菌中，PhaR在其PHA積累和顆粒形成中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。 l 嗜鹽古菌：中溫培養(yǎng)，好氧，原生質(zhì)體較好制備，容易遺傳轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒豐富，但胞內(nèi)高鹽，需研發(fā)自己的遺傳操作體系。 依賴PAM 過程需要 Cas1Cas2 來募集 Cas3。它是細菌和古細菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。染色體靶向易位：染色體易位常常與腫瘤發(fā)生有著密不可分的關(guān)系，因此染色體易位的研究對于人們認識腫瘤的發(fā)病機理尤為重要。形態(tài)轉(zhuǎn)換：白色念珠菌形態(tài)多樣性，具有兩種典型的形態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)即White和 Opaque。平衡了種群長期進化與短期快速環(huán)境適應(yīng)的之間的矛盾 以最經(jīng)濟節(jié)約的方式達到目的。白色念珠菌可以通過遮掩betaglycan來逃避和抵抗免疫系統(tǒng)的攻擊，使暴露betaglycan即可激活免疫反應(yīng)，從而治療真菌疾病。老師講授的CRISPR技術(shù)也是目前計較熱的基因組編輯技術(shù)，是我們對這項技術(shù)有個比較詳盡的了解。 首先，鏈霉菌方面，譚老師和劉老師的研究部分是鏈霉菌（放線菌）的遺傳特性以及次生代謝的分子調(diào)控以及其遺傳基礎(chǔ)與操作知識。在特定的條件下，細菌可以形成生物被膜，包被有生物被膜的細菌稱為被膜菌。CO2感應(yīng)研究將揭示白念珠菌宿主環(huán)境 適應(yīng)和感染的機制?？傊?，CRISPRCas9是細菌的一種“獲得性免疫系統(tǒng)”。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組DNA 片段靶向編輯方面的研究和應(yīng)用，主要包括DNA 片段的刪除、反轉(zhuǎn)、重復(fù)、插入和易位，這一有效的DNA 片段編輯方法為研究基因功能、調(diào)控元件、組織發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展提供了有力手段。適應(yīng)過程需要被某一spacer引發(fā)至同源的外源DNA。 2) 嗜鹽古菌具有獨特的鹽適應(yīng)機制和功能物質(zhì)，因其制備的方便性和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為現(xiàn)代生命科學的發(fā)展和生物技術(shù)的進步起到了重要的推動作用。若該基因敲除后，單獨敲除該目標基因的突變株仍然能夠合成該物質(zhì)，那么可以說明，該基因編碼的物質(zhì)可以由多種途徑合成或者有編碼該產(chǎn)物的同源基因，說明該基因是非必需的，否則該基因可能是重要的或者必不可少的。這樣的鹽類物質(zhì)組合讓這種鹽水得以有可能在火星表面穩(wěn)定存在足夠長的時間，所以推測可能有嗜鹽微生物的存在。因此，我推測火星上機油可能存在光合細菌。 哪些分子生物學特性使極端嗜熱古菌成為地球上最耐熱的生命形式？l 細胞膜的結(jié)構(gòu)特殊：一般的真菌和細菌的細胞膜是酯鍵，100℃ 以上細菌細胞膜損毀，古菌細胞膜更穩(wěn)定，是醚鍵，而甘油與異戊二烯衍生物組成的醚鍵更加穩(wěn)定，因此細胞膜的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定使得極端嗜熱古菌成為地球上最耐熱的生命形式。第五章 古菌1 16S rRNA的功能機制是什么？ 細菌含有的核糖體分為23S，16S和5S rRNA 3種類型，其分子由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成，其中某些堿基序列在相當長期的進化過程中保持恒定。谷氨酸棒桿菌對pH的應(yīng)答是個復(fù)雜的過程，它與氧化脅迫、鐵離子平衡以及新陳代謝相聯(lián)系。c. 引入外源基因 ：C. glutamicum ATCC14067 (pJCtacvgb)具有較高的氧吸收率，VHb蛋白提高了重組菌的呼吸效率。l 生物素：當生物素過量時,菌體生長繁殖快,谷氨酸合成途徑受阻,發(fā)酵液中由菌種細胞排出的谷氨酸僅能占氨基酸總量的12%；生物素適量時,菌體代謝失調(diào),細胞膜通透性增強,細胞內(nèi)的谷氨酸能及時排出,有利于谷氨酸的積累。谷氨酸生物合成途徑以及代謝途徑：谷氨酸生物合成：三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生α酮戊二酸，當αKGA（ α酮戊二酸）脫氫酶酶活性微弱或喪失時， α酮戊二酸會在NADPH和NH4+ 在谷氨酸脫氫酶作用下，合成谷氨酸，而不會生成琥珀酸，脫離三羧酸循環(huán)而生成谷氨酸，最后透過細胞膜分泌到胞外。分泌蛋白至培養(yǎng)基、細胞壁及插入蛋白至細胞質(zhì)膜。納豆激酶的分離純化粗提方法即是將發(fā)酵液或納豆浸提液離心取上清，用硫酸銨或乙醇沉淀，再經(jīng)離心除去上清液中的粘性物質(zhì)，離心后取沉淀，溶于緩沖液中即為粗酶液。生物膜形成過程中的最主要抑制子：SinR，它是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，可以抑制基質(zhì)形成基因的表達，也可以促進細胞運動相關(guān)基因的表達，因此形成生物膜需抑制SinR蛋白的表達。l 生物大分子合成前相應(yīng)基本結(jié)構(gòu)單元需要活化，活化后的分子具有高能量，便于后續(xù)合成反應(yīng)。D、轉(zhuǎn)肽酶：這些酶大多是藥物的潛在作用靶點，對其結(jié)構(gòu)功能的研究是熱點。B、 大腸桿菌細胞高產(chǎn)抗癌藥物前體紫杉醇(taxol)前體taxadiene。不同的營養(yǎng)（如不同的碳源和氮源等）條件導(dǎo)致不同的生理代謝。而除了調(diào)控次級代謝產(chǎn)物的生物合成外，很多全局調(diào)控蛋白還控制著鏈霉菌的形態(tài)分化，還有一些能夠調(diào)控初級代謝，并成為初級代謝向次級代謝轉(zhuǎn)換的媒介。越來越多的證據(jù)表明，次級代謝實際上參與了生物體對環(huán)境因子應(yīng)答等多種生理作用。大片段DNA克隆的技術(shù)：l 依賴于酵母菌的轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的大片段DNA重組克隆（TAR）l 基于FBT1 attpattBint整合系統(tǒng)的鏈霉菌基因組DNA大片段克隆技術(shù)：通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒pSV::attB6Up導(dǎo)入鏈霉菌，卡那霉素篩選獲得pSV::attB6Up同源整合到目的位置的菌株SattB6。但是環(huán)境是可變的，如果生物不變，那就很可能被淘汰。突變的生物學意義：基因突變導(dǎo)致了基因表達出來的性狀發(fā)生了改變，對突變個體本身來講，絕大多數(shù)是有害的，因為現(xiàn)有的生物基本上都適應(yīng)了現(xiàn)在的環(huán)境。而環(huán)化的DNA由于不能在鏈霉菌中復(fù)制，隨著傳代而丟失。 鏈霉菌為什么會產(chǎn)生如此多樣性的次級代謝產(chǎn)物？他們對鏈霉菌本身有何意義？（劉鋼老師） 次級代謝產(chǎn)物通常是指不是生物體生長發(fā)育所必需的分子量小于3KDa的小分子物質(zhì)。全局性調(diào)控蛋白對抗生素生物合成的調(diào)控通常是通過直接或間接地調(diào)控途徑特異性調(diào)控蛋白實施的。2. 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：微生物只能在適合的條件下生長和繁殖。從而合成生物大分子蛋白質(zhì)類藥物。由RamR和小分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵殘基P