【正文】 微生物遺傳與分子生物學（5*15+1*25=100分）本課程主要涉及到微生物中主要的模式菌株:原核微生物: 放線菌(鏈霉菌),大腸桿菌,芽孢桿菌,乳酸菌，古菌等。真核微生物：漢遜酵母，釀酒酵母，白念珠菌等。第1章 概論基因的符號：每個基因：如色氨酸基因trp；同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。當染色體上發(fā)生缺失時可用Δ表示（如ΔtrpA或ΔtrpA）；基因突變：如亮氨酸缺陷型leu；抗藥性基因：r表示抗性，加s表示敏感如鏈霉素抗性基因表示為strr，敏感基因表示為strs。 微生物基因突變一般分幾種類型,突變有什么生物學意義?（譚老師）基因突變可從突變發(fā)生方式和突變引起的表型改變和遺傳物質(zhì)改變等方面進行分類。按突變體表型特征的不同，可把突變分為以下4個類型:1). 形態(tài)突變型2). 生化突變型3). 致死突變型:按突變所引起的遺傳信息的改變，又可把突變分為：1). 錯義突變 2). 同義突變3). 無義突變 根據(jù)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，可分為堿基置換、移碼、DNA片段插入和缺失。根據(jù)突變發(fā)生的方式，可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。突變的生物學意義：基因突變導(dǎo)致了基因表達出來的性狀發(fā)生了改變，對突變個體本身來講，絕大多數(shù)是有害的，因為現(xiàn)有的生物基本上都適應(yīng)了現(xiàn)在的環(huán)境。但是環(huán)境是可變的，如果生物不變，那就很可能被淘汰。所以，對整個生物群體來說，突變使群體不會滅亡。環(huán)境不斷改變，生物通過不斷突變而適應(yīng), 也就使其被保存下來。最終，物種的面貌特征與祖先不同，所以說，突變是生物進化的內(nèi)因，是進化的主要動力。 無數(shù)事實說明了一個真理，即宇宙間的所有物種變是絕對的，不變則是相對的。 應(yīng)用于鏈霉菌基因組編輯與大片段DNA克隆的技術(shù)都有哪些？能否用在你們今后的實驗中？（劉鋼老師） 基因組編輯是指在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術(shù)。原理是構(gòu)建一個人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過程中會產(chǎn)生突變，從而達到改造基因組的目的。鏈霉菌基因組編輯有：l ISecI endonuclease介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)：敲除質(zhì)粒上含有一串聯(lián)的與靶片段左右臂同源的兩個DNA片段以及ISecI識別的18個堿基的位點（sceS）。將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌細胞，并通過抗性篩選質(zhì)粒插入到基因組上的克隆。如果發(fā)生同源單交換，該質(zhì)粒將被完整導(dǎo)入基因組靶位點。通過誘導(dǎo)表達SecI，SecI在18個堿基的位點（sceS）切斷基因組DNA，菌體不能夠存活。如果發(fā)生同源雙交換， sceS被刪除，即使誘導(dǎo)表達SecI也不會造成基因組DNA的斷裂，菌體仍然存活，并表現(xiàn)出抗性敏感。l CRISPRCas9介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)：首先優(yōu)化cas9的密碼子，將其放置在強啟動子之后并克隆到敲除質(zhì)粒上，敲除質(zhì)粒上含有sgRNA并置于組成型啟動子之后， sgRNA中的引導(dǎo)序列為靶位點的同源序列，敲除質(zhì)粒必須包括靶基因兩側(cè)的同源臂。將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將靶位點切斷，同時質(zhì)粒上的同源臂與基因組上的同源臂發(fā)生雙交換，將斷裂的靶基因區(qū)刪除，基因組重新連接。（CRISPR/Cas9系統(tǒng)先切斷靶序列后直接發(fā)生雙交換，最后斷裂的靶基因直接被敲除）l 位點特異性整合酶介導(dǎo)的基因組編輯：（cre/lox系統(tǒng)）利用兩次同源單交換分別將兩個loxP位點整合到目的基因片段的上下游，再將Cre蛋白表達質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，在Cre蛋白的作用下，兩個loxP位點發(fā)生位點特異性重組，完成目的基因片段的敲除。而環(huán)化的DNA由于不能在鏈霉菌中復(fù)制，隨著傳代而丟失。大片段DNA克隆的技術(shù)：l 依賴于酵母菌的轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的大片段DNA重組克隆（TAR）l 基于FBT1 attpattBint整合系統(tǒng)的鏈霉菌基因組DNA大片段克隆技術(shù)：通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒pSV::attB6Up導(dǎo)入鏈霉菌，卡那霉素篩選獲得pSV::attB6Up同源整合到目的位置的菌株SattB6。再將pKC1139::attP6Dn導(dǎo)入SattB6，在40度培養(yǎng)， pKC1139::attP6Dn通過同源單交換整合到目的位置獲得SattB6P6。通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將含有FBT1整合酶的pIJ10500導(dǎo)入SattB6P6中，利用整合酶將目的基因簇環(huán)出，并克隆到載體pKC1139上。在今后的實驗中可能會用到： 我們實驗室是分子生物學實驗室，這些技術(shù)方法對于我今后的研究室有助益的。我們平時多采用基本的遺傳操作，構(gòu)建敲除質(zhì)粒載體，然后導(dǎo)入受體菌株進行同源重組進行單交換，利用抗生素進行篩選，隨后還需要進行雙交換。我們可以考慮使用基因編輯技術(shù)來進行遺傳操做。比如應(yīng)用CRISPRCas9介導(dǎo)的同源重組基因編輯技術(shù)來使之直接發(fā)生雙交換而直接敲除靶標基因，這樣操作起來并不繁瑣，也省去了些過程，并且對是否發(fā)生雙交換也比較好判斷。 作為絲狀細菌的鏈霉菌經(jīng)歷一個怎樣的分化過程？對其自身有何意義？（劉鋼老師）作為絲狀細菌鏈霉菌的分化過程為：1，孢子萌發(fā)形成基質(zhì)菌絲；2，基質(zhì)菌絲延伸、分枝；（光禿表型）3，向空氣中生長形成氣生菌絲；4，氣生菌絲產(chǎn)生螺旋和分隔；（白表型）5，分隔加深形成孢子鏈；6，孢子鏈變灰，成熟；（灰表型）7，釋放游離孢子。 鏈霉菌的發(fā)育分化過程中有部分的基質(zhì)菌絲和未分化成為孢子的氣生菌絲存在有死亡現(xiàn)象，這些菌絲的死亡發(fā)生在鏈霉菌分化過程中的特定時間和區(qū)域。，首先是死亡的菌絲體并未顯示出PCD所特有的表觀特征，其次是死亡的菌絲體并未完全消失，保留的殘體既可以作為機械支撐用于氣生菌絲分化從而脫離培養(yǎng)基表面，同時也可作為水分和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸通道。 對其自身的意義：營養(yǎng)生長階段，基質(zhì)菌絲經(jīng)過頂端生長和分支，在感受到環(huán)境中的營養(yǎng)限制或者其他壓力后，以應(yīng)對環(huán)境脅迫，鏈霉菌通過bld基因級聯(lián)信號通路產(chǎn)生疏水分子SapB，從而賦予菌絲表面疏水特性而使其突破培養(yǎng)基表面的氣水張力進入繁殖性的氣生菌絲階段，然后又通過whi基因等的級聯(lián)信號通路控制下產(chǎn)生孢子，孢子成熟后飄落到適宜的環(huán)境中在進行上述過程生活。這種分化過程可以賦予鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫的能力。進行生殖生長產(chǎn)生氣生菌絲和孢子，成熟孢子隨風或其他生物帶到更加適宜其生活的環(huán)境中，對于鏈霉菌自身是十分重要的生活方式，使之區(qū)別物其他的原核生物，所以這種發(fā)育分化過程對于鏈霉菌自身意義重大。鏈霉菌發(fā)育分化中的細胞死亡過程其生理學意義可能在于：當鏈霉菌在生長過程中感受到環(huán)境中的營養(yǎng)限制或者其它壓力時，通過細胞死亡可為其孢子形成提供營養(yǎng)物質(zhì)，伴隨著基質(zhì)菌絲向氣生菌絲的轉(zhuǎn)變，鏈霉菌通常會在這一時期產(chǎn)生抗生素，這對于鏈霉菌專一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具有重要的意義。鏈霉菌發(fā)育分化和次級代謝產(chǎn)物的合成一般都是起始于對環(huán)境中營養(yǎng)匱乏的感應(yīng)。 鏈霉菌為什么會產(chǎn)生如此多樣性的次級代謝產(chǎn)物？他們對鏈霉菌本身有何意義？（劉鋼老師） 次級代謝產(chǎn)物通常是指不是生物體生長發(fā)育所必需的分子量小于3KDa的小分子物質(zhì)。越來越多的證據(jù)表明，次級代謝實際上參與了生物體對環(huán)境因子應(yīng)答等多種生理作用。廣泛意義上的抗生素囊括了幾乎所有的微生物次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物在極低的濃度在生化水平調(diào)控微生物的生長過程。 抗生素是逐步合成的代謝產(chǎn)物, 每一步都需要約10 一30 個基因來決定其結(jié)構(gòu)和起自我保護作用抗性基因, 以及控制結(jié)構(gòu)基因活性的調(diào)控基因, 并使它們隨特性生存需要給予表達。 這常常與活性營養(yǎng)生長和抱子形成之間的轉(zhuǎn)變相一致。鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對其本身的意義：當鏈霉菌在生長過程中感受到環(huán)境中的營養(yǎng)限制或者其它壓力時，伴隨著由基質(zhì)菌絲形成氣生菌絲，菌體周圍的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，鏈霉菌開始降解自身的基質(zhì)菌絲為形成繁殖型的氣生菌絲提供營養(yǎng)，同時各種次級代謝產(chǎn)物（抗生素）開始產(chǎn)生，而次級代謝產(chǎn)物可以幫助鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫，從而創(chuàng)造利于自身生活的環(huán)境。這對于鏈霉菌專一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具有重要的意義。這些次級代謝產(chǎn)物在極低的濃度下，可以在生化水平調(diào)控微生物的生長過程對菌體的生長也具有重要的生物學意義。抗生素還具有抑制它種微生物生長活動、甚至殺滅它種微生物的能力，這就為鏈霉菌的生活創(chuàng)造了相對較好的條件。 調(diào)控基因在抗生素生物合成中有何主要功能？ 抗生素生物合成基因簇一般由調(diào)控基因、結(jié)構(gòu)基因和相關(guān)抗性基因組成，而且這些基因總是成簇排列。在抗生素生物合成中調(diào)控基因起到了一個開關(guān)的作用, 它可決定一種抗生素能否被合成、什么時候合成和什么時候被終止的精細調(diào)控作用。1. 抗生素生物合成的途徑特異性調(diào)控：鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇通常成簇排列，包括一個或多個調(diào)控基因，一般只負責調(diào)控所在基因簇基因表達的調(diào)控稱之為途徑特異性調(diào)控。途徑特異性調(diào)控蛋白如SARP蛋白，SARP蛋白都含有OmpR類的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，通過招募RNA聚合酶到靶基因的啟動子上游激活基因的轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)SARP蛋白都是途徑特異性調(diào)控子，一般只調(diào)控與其相鄰的基因。2. 全局性調(diào)控：相對于鏈霉菌次級代謝中的其他調(diào)控模式而言，全局調(diào)控是一種更為多樣、普遍、復(fù)雜的調(diào)控模式。全局調(diào)控基因可以調(diào)控多條次級代謝途徑。全局性調(diào)控蛋白對抗生素生物合成的調(diào)控通常是通過直接或間接地調(diào)控途徑特異性調(diào)控蛋白實施的。而除了調(diào)控次級代謝產(chǎn)物的生物合成外，很多全局調(diào)控蛋白還控制著鏈霉菌的形態(tài)分化，還有一些能夠調(diào)控初級代謝，并成為初級代謝向次級代謝轉(zhuǎn)換的媒介。Eg. 雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、AdpA3. 抗生素生物合成的自調(diào)控反饋調(diào)控和前饋調(diào)饋：（抗生素介導(dǎo)的自調(diào)控）反饋調(diào)控: 指一種微生物代謝反應(yīng)的終產(chǎn)物在代謝合成過程中對合成基因簇中調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控 (如抗生素)。前饋調(diào)控：指一種微生物代謝反應(yīng)的底物或中間物在代謝合成過程中對合成基因簇中調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控。l 抗生素作為終產(chǎn)物介導(dǎo)的自調(diào)控系統(tǒng)可取代雙組分系統(tǒng)中通過磷酸化作用的應(yīng)答調(diào)控機制，并證明這種新調(diào)控機制在微生物次級代謝生物合成中是廣泛存在的。 鏈霉菌信號分子有哪幾種類型, GBL類型的信號分子在抗生素生物合成中如何發(fā)揮其功能? 菌群群體反應(yīng)感應(yīng)信號分子當信號分子達到閾值啟動特定基因表達改變和協(xié)調(diào)細胞間行為使群體呈現(xiàn)某種生理特征。鏈霉菌信號分子的類型：高絲氨酸內(nèi)酯(HSL)、自誘導(dǎo)肽(AIP)、AIγ丁酸內(nèi)酯(GBL)、DSF、PQS、法尼醇等。目前研究得最多的群體感應(yīng)系統(tǒng)有以下四種：革蘭氏陰性菌中的?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)、革蘭氏陽性菌中的自誘導(dǎo)肽(AIP)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)、呋喃硼酸二酯結(jié)構(gòu)的AI2介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)系統(tǒng)和γ丁酸內(nèi)酯(GBL)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)。GBL類型的信號分子在抗生素生物合成中發(fā)揮功能：鏈霉菌廣泛使用γ丁酸內(nèi)酯（GBL）類化合物作為自調(diào)控因子。GBL在胞內(nèi)合成并分泌到胞外，當達到一定閾值濃度時，能夠被胞內(nèi)的受體蛋白所感知，從而引起群體反應(yīng)(抗生素合成或產(chǎn)孢)。信號分子（A因子GBL）的受體蛋白ArpA與多效調(diào)空基因adpA的啟動子區(qū)結(jié)合, 阻遏了adpA的轉(zhuǎn)錄。當A因子（GBL）積累到閾值時，它與ArpA結(jié)合，使ArpA從adpA上解離，導(dǎo)致adpA有效地進行轉(zhuǎn)錄。翻譯后的AdpA控制鏈霉素生物合成基因簇中調(diào)控基因strR的轉(zhuǎn)錄, StrR激活strB1開始的這個轉(zhuǎn)錄單元的基因轉(zhuǎn)錄, 從而調(diào)控鏈霉素的生物合成。 有哪些方法或策略可以得到新型抗生素?1. 更多鏈霉菌基因組的測序及挖掘：隨著更多鏈霉菌基因組的不斷完成和信息積累, 為抗生素生物合成基因簇的研究，發(fā)現(xiàn)新型抗生素提供了重要的條件。大量的鏈霉菌尚未測序，這極大地影響了新型抗生素的發(fā)現(xiàn)。每個基因組平均含有2030個左右次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，大多數(shù)是未知的，這將是發(fā)現(xiàn)新型抗生素的龐大資源。2. 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：微生物只能在適合的條件下生長和繁殖。不同的營養(yǎng)（如不同的碳源和氮源等）條件導(dǎo)致不同的生理代謝。次級代謝產(chǎn)物的生物合成是與前體的提供和相關(guān)因子的誘導(dǎo)密切相關(guān)的。同時，相關(guān)菌株的共同培養(yǎng)可以提供互補的重要物質(zhì)和信息交流，這為隱性次級代謝基因簇的激活提供了可能的條件。3. 調(diào)控子的遺傳操作：隱性次級代謝基因簇在受阻遏和缺乏激活因子的情況下不能得到表達，去除負調(diào)控基因的阻遏和構(gòu)建正調(diào)控基因的有效表達是激活隱性次級代謝基因簇表達的策略之一。此外，對轉(zhuǎn)錄單元中啟動子的替換和定向改造也是隱性次級代謝基因簇激活的有效方法。4. 基因簇的異源表達：為了消除菌株本身的一些限制因素，進行隱性次級代謝基因簇的異源表達也是值得嘗試的方法。5. 信號分子介導(dǎo)的激活：γ丁酸內(nèi)酯（GBL）作為放線菌的信號分子，通過與相應(yīng)的受體蛋白相互作用，進而激活多種次級代謝產(chǎn)物的生物合成。除GBL外, 在抗生素生物合成中信號分子具有多樣性和多效性, 如抗生素本身可作為信號分子, ATP和肌醇等可作為信號分子參與抗生素的生物合成和形態(tài)分化的分子調(diào)控。發(fā)現(xiàn)新信號分子，研究其在抗生素產(chǎn)生和種間交流中的作用機制；同時可用于激活隱性基因簇；探索抗生素作為信號分子在自然生境中的生物學功能。6. 核糖體工程：在鏈霉菌中，核糖體蛋白S12的突變同樣可以影響抗生素的產(chǎn)量。7. 其他新方法和策略未來可能的突破：以鏈霉菌為模式，進一步闡明抗生素生物合成與調(diào)控機制，為提高重要抗生素的產(chǎn)量乃至激活隱基因簇，挖掘新型活性次級代謝產(chǎn)物方面做出創(chuàng)新性的研究成果 ；深入開展抗生素的組合生物合成和合成生物學的研究，突破天然產(chǎn)物合成過程中的瓶頸，獲得在結(jié)構(gòu)和功能上具有突出特點的新型活性化合物。第四章 大腸桿菌 芽孢桿菌 棒桿菌 乳酸菌 結(jié)合大腸桿菌（致病和非致?。┑募毎Y(jié)構(gòu)特征及其生物大分子的生物合成規(guī)律，簡述若干種藥物研發(fā)的策略。藥物研發(fā)策略：生產(chǎn)某種物質(zhì)，綜合策略： 拓展底物利用能力和范圍（“進”） 加快產(chǎn)物轉(zhuǎn)到胞外（“出”）