【正文】 鞭毛，能運動，有菌毛。E、抗生素作用的靶標或抗性菌株突變的位點：例如，萬古霉素作用位點為雙丙氨酰，抑制細胞壁的合成 而其對應(yīng)的耐藥菌株末尾的丙氨酸突變?yōu)槿樗?。由RamR和小分子復合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵殘基Phe155，從而有助于篩選與其結(jié)合的潛在藥物。作用于致病大腸桿菌的藥物的研發(fā)：D、外排泵的抑制子作為潛在的藥物靶標：TetR類抑制子控制本底水平的外排泵AcrA和AcrB的表達； AraC類的激活子能解除TetR的抑制，使外排泵大量表達； MarR類的抑制子能夠抑制AraC的轉(zhuǎn)錄，間接影響外排泵表達。ATP, NADH/NAD+, NADPH/NADP+等輔因子參與很多重要胞內(nèi)代謝過程，其水平及比例可導致微生物代謝及生理發(fā)生全局變化。因此，上游模塊：增加整個MEP途徑的拷貝數(shù)；在染色體中引入T7 RNA 聚合酶，并在限速酶前引入T7啟動子；通過不同質(zhì)粒的引入和改變啟動子強度來協(xié)調(diào)不同基因的拷貝數(shù)以及表達量；將合成酶基因整合到染色體上，減小代謝負擔。從而合成生物大分子蛋白質(zhì)類藥物。第四章 大腸桿菌 芽孢桿菌 棒桿菌 乳酸菌 結(jié)合大腸桿菌（致病和非致病）的細胞結(jié)構(gòu)特征及其生物大分子的生物合成規(guī)律，簡述若干種藥物研發(fā)的策略。除GBL外, 在抗生素生物合成中信號分子具有多樣性和多效性, 如抗生素本身可作為信號分子, ATP和肌醇等可作為信號分子參與抗生素的生物合成和形態(tài)分化的分子調(diào)控。3. 調(diào)控子的遺傳操作：隱性次級代謝基因簇在受阻遏和缺乏激活因子的情況下不能得到表達，去除負調(diào)控基因的阻遏和構(gòu)建正調(diào)控基因的有效表達是激活隱性次級代謝基因簇表達的策略之一。2. 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：微生物只能在適合的條件下生長和繁殖。翻譯后的AdpA控制鏈霉素生物合成基因簇中調(diào)控基因strR的轉(zhuǎn)錄, StrR激活strB1開始的這個轉(zhuǎn)錄單元的基因轉(zhuǎn)錄, 從而調(diào)控鏈霉素的生物合成。GBL類型的信號分子在抗生素生物合成中發(fā)揮功能：鏈霉菌廣泛使用γ丁酸內(nèi)酯（GBL）類化合物作為自調(diào)控因子。l 抗生素作為終產(chǎn)物介導的自調(diào)控系統(tǒng)可取代雙組分系統(tǒng)中通過磷酸化作用的應(yīng)答調(diào)控機制，并證明這種新調(diào)控機制在微生物次級代謝生物合成中是廣泛存在的。全局性調(diào)控蛋白對抗生素生物合成的調(diào)控通常是通過直接或間接地調(diào)控途徑特異性調(diào)控蛋白實施的。途徑特異性調(diào)控蛋白如SARP蛋白，SARP蛋白都含有OmpR類的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，通過招募RNA聚合酶到靶基因的啟動子上游激活基因的轉(zhuǎn)錄?？股剡€具有抑制它種微生物生長活動、甚至殺滅它種微生物的能力，這就為鏈霉菌的生活創(chuàng)造了相對較好的條件。 這常常與活性營養(yǎng)生長和抱子形成之間的轉(zhuǎn)變相一致。 鏈霉菌為什么會產(chǎn)生如此多樣性的次級代謝產(chǎn)物？他們對鏈霉菌本身有何意義？（劉鋼老師） 次級代謝產(chǎn)物通常是指不是生物體生長發(fā)育所必需的分子量小于3KDa的小分子物質(zhì)。這種分化過程可以賦予鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫的能力。 作為絲狀細菌的鏈霉菌經(jīng)歷一個怎樣的分化過程？對其自身有何意義？（劉鋼老師）作為絲狀細菌鏈霉菌的分化過程為：1，孢子萌發(fā)形成基質(zhì)菌絲；2，基質(zhì)菌絲延伸、分枝；（光禿表型）3，向空氣中生長形成氣生菌絲；4，氣生菌絲產(chǎn)生螺旋和分隔；（白表型）5，分隔加深形成孢子鏈；6，孢子鏈變灰，成熟；（灰表型）7，釋放游離孢子。在今后的實驗中可能會用到： 我們實驗室是分子生物學實驗室，這些技術(shù)方法對于我今后的研究室有助益的。而環(huán)化的DNA由于不能在鏈霉菌中復制，隨著傳代而丟失。如果發(fā)生同源雙交換， sceS被刪除，即使誘導表達SecI也不會造成基因組DNA的斷裂，菌體仍然存活，并表現(xiàn)出抗性敏感。鏈霉菌基因組編輯有：l ISecI endonuclease介導的同源重組系統(tǒng)：敲除質(zhì)粒上含有一串聯(lián)的與靶片段左右臂同源的兩個DNA片段以及ISecI識別的18個堿基的位點（sceS）。最終，物種的面貌特征與祖先不同，所以說，突變是生物進化的內(nèi)因，是進化的主要動力。突變的生物學意義：基因突變導致了基因表達出來的性狀發(fā)生了改變，對突變個體本身來講，絕大多數(shù)是有害的，因為現(xiàn)有的生物基本上都適應(yīng)了現(xiàn)在的環(huán)境。當染色體上發(fā)生缺失時可用Δ表示（如ΔtrpA或ΔtrpA）；基因突變：如亮氨酸缺陷型leu；抗藥性基因：r表示抗性，加s表示敏感如鏈霉素抗性基因表示為strr，敏感基因表示為strs。微生物遺傳與分子生物學（5*15+1*25=100分）本課程主要涉及到微生物中主要的模式菌株:原核微生物: 放線菌(鏈霉菌),大腸桿菌,芽孢桿菌,乳酸菌，古菌等。 微生物基因突變一般分幾種類型,突變有什么生物學意義?（譚老師）基因突變可從突變發(fā)生方式和突變引起的表型改變和遺傳物質(zhì)改變等方面進行分類。但是環(huán)境是可變的，如果生物不變，那就很可能被淘汰。 無數(shù)事實說明了一個真理，即宇宙間的所有物種變是絕對的，不變則是相對的。將該質(zhì)粒導入鏈霉菌細胞，并通過抗性篩選質(zhì)粒插入到基因組上的克隆。l CRISPRCas9介導的同源重組系統(tǒng)：首先優(yōu)化cas9的密碼子，將其放置在強啟動子之后并克隆到敲除質(zhì)粒上，敲除質(zhì)粒上含有sgRNA并置于組成型啟動子之后， sgRNA中的引導序列為靶位點的同源序列，敲除質(zhì)粒必須包括靶基因兩側(cè)的同源臂。大片段DNA克隆的技術(shù)：l 依賴于酵母菌的轉(zhuǎn)化介導的大片段DNA重組克隆（TAR）l 基于FBT1 attpattBint整合系統(tǒng)的鏈霉菌基因組DNA大片段克隆技術(shù)：通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒pSV::attB6Up導入鏈霉菌，卡那霉素篩選獲得pSV::attB6Up同源整合到目的位置的菌株SattB6。我們平時多采用基本的遺傳操作，構(gòu)建敲除質(zhì)粒載體，然后導入受體菌株進行同源重組進行單交換，利用抗生素進行篩選，隨后還需要進行雙交換。 鏈霉菌的發(fā)育分化過程中有部分的基質(zhì)菌絲和未分化成為孢子的氣生菌絲存在有死亡現(xiàn)象，這些菌絲的死亡發(fā)生在鏈霉菌分化過程中的特定時間和區(qū)域。進行生殖生長產(chǎn)生氣生菌絲和孢子，成熟孢子隨風或其他生物帶到更加適宜其生活的環(huán)境中，對于鏈霉菌自身是十分重要的生活方式，使之區(qū)別物其他的原核生物，所以這種發(fā)育分化過程對于鏈霉菌自身意義重大。越來越多的證據(jù)表明，次級代謝實際上參與了生物體對環(huán)境因子應(yīng)答等多種生理作用。鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對其本身的意義：當鏈霉菌在生長過程中感受到環(huán)境中的營養(yǎng)限制或者其它壓力時，伴隨著由基質(zhì)菌絲形成氣生菌絲，菌體周圍的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，鏈霉菌開始降解自身的基質(zhì)菌絲為形成繁殖型的氣生菌絲提供營養(yǎng)，同時各種次級代謝產(chǎn)物（抗生素）開始產(chǎn)生，而次級代謝產(chǎn)物可以幫助鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫，從而創(chuàng)造利于自身生活的環(huán)境。 調(diào)控基因在抗生素生物合成中有何主要功能？ 抗生素生物合成基因簇一般由調(diào)控基因、結(jié)構(gòu)基因和相關(guān)抗性基因組成，而且這些基因總是成簇排列。大多數(shù)SARP蛋白都是途徑特異性調(diào)控子，一般只調(diào)控與其相鄰的基因。而除了調(diào)控次級代謝產(chǎn)物的生物合成外，很多全局調(diào)控蛋白還控制著鏈霉菌的形態(tài)分化，還有一些能夠調(diào)控初級代謝，并成為初級代謝向次級代謝轉(zhuǎn)換的媒介。 鏈霉菌信號分子有哪幾種類型, GBL類型的信號分子在抗生素生物合成中如何發(fā)揮其功能? 菌群群體反應(yīng)感應(yīng)信號分子當信號分子達到閾值啟動特定基因表達改變和協(xié)調(diào)細胞間行為使群體呈現(xiàn)某種生理特征。GBL在胞內(nèi)合成并分泌到胞外，當達到一定閾值濃度時，能夠被胞內(nèi)的受體蛋白所感知，從而引起群體反應(yīng)(抗生素合成或產(chǎn)孢)。 有哪些方法或策略可以得到新型抗生素?1. 更多鏈霉菌基因組的測序及挖掘：隨著更多鏈霉菌基因組的不斷完成和信息積累, 為抗生素生物合成基因簇的研究，發(fā)現(xiàn)新型抗生素提供了重要的條件。不同的營養(yǎng)（如不同的碳源和氮源等）條件導致不同的生理代謝。此外，對轉(zhuǎn)錄單元中啟動子的替換和定向改造也是隱性次級代謝基因簇激活的有效方法。發(fā)現(xiàn)新信號分子，研究其在抗生素產(chǎn)生和種間交流中的作用機制；同時可用于激活隱性基因簇；探索抗生素作為信號分子在自然生境中的生物學功能。藥物研發(fā)策略：生產(chǎn)某種物質(zhì)，綜合策略： 拓展底物利用能力和范圍（“進”） 加快產(chǎn)物轉(zhuǎn)到胞外（“出”） 加強目標合成酶活性（“加”） 減少分支合成途徑（“減”） 引入新的合成途徑，或延伸已有途徑（“增”） 改善細胞的耐受性定向遺傳修飾利用大腸桿菌合成相關(guān)藥物：A、 大腸桿菌產(chǎn)生蛋白類藥物 ：優(yōu)先選用的蛋白藥物表達宿主，即利用上述的策略來進行定向遺傳改造而合成蛋白類藥物。B、 大腸桿菌細胞高產(chǎn)抗癌藥物前體紫杉醇(taxol)前體taxadiene。下游模塊：改變GGPS和TS兩個合成基因的順序；通過啟動子更換以及改造，協(xié)調(diào)基因的表達量；去除代謝抑制子indole。與生物大分子的合成相關(guān)， NADPH/NADP+增加有利于生物大分子的合成。抗生素或小分子與抑制子結(jié)合，減弱其與靶標DNA的結(jié)合，從而解除其對激活子抑制作用，進而促進下游外排泵的高表達。D、轉(zhuǎn)肽酶：這些酶大多是藥物的潛在作用靶點，對其結(jié)構(gòu)功能的研究是熱點。 細胞結(jié)構(gòu)特征：細胞內(nèi)沒有成形的細胞核；含有質(zhì)粒；基因組或質(zhì)粒上含有“致病島” 它是一段特殊的DNA片段，包含毒素分泌系統(tǒng)，粘附素等，能夠在菌株和相近種之間轉(zhuǎn)移。毒性因子：菌毛：大多由質(zhì)粒編碼，成束狀，起粘附宿主作用。與低相對分子量的生物有機化合物相比，生物大分子具有更高級的物質(zhì)群。l 生物大分子合成前相應(yīng)基本結(jié)構(gòu)單元需要活化，活化后的分子具有高能量，便于后續(xù)合成反應(yīng)。Bacillus cereus group均為能夠形成孢子的菌株，基因及基因組序列數(shù)據(jù)顯示其種間密切相關(guān)，即染色體具有很高的的相似性和共線性，甚至被認為屬于相同的種，其包含6個不同的種：1) B. cereus sensu stricto: 狹義的蠟狀芽孢桿菌，廣泛存在于土壤中，能引起食品污染，導致人類嘔吐和腹瀉，并且有些菌株能引起軟組織感染的機會致病菌。a. 蘇云金芽胞桿菌主要特征是在芽胞形成的同時產(chǎn)生伴胞晶體即δ內(nèi)毒素,而編碼這些晶體蛋白的基因主要位于質(zhì)粒上。3) 質(zhì)粒大小變化也很大，從2kb到大于600kb，且不同菌株的質(zhì)粒譜型并不總與其系統(tǒng)發(fā)育相匹配。生物膜形成過程中的最主要抑制子：SinR，它是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，可以抑制基質(zhì)形成基因的表達，也可以促進細胞運動相關(guān)基因的表達，因此形成生物膜需抑制SinR蛋白的表達。 感受態(tài)的形成主要包括三個過程：群感效應(yīng)系統(tǒng)，主要調(diào)控子ComK的激活，ComK激活下游感受態(tài)相關(guān)基因。3　 ComK的釋放： 群感效應(yīng)信號分子ComX及CSF可以促使ComA~P的水平升高， ComA~P能夠促進表面活性素—surfactin基因簇的轉(zhuǎn)錄，而位于此基因簇上的S同時被轉(zhuǎn)錄。1 簡述納豆激酶產(chǎn)品開發(fā)的實驗設(shè)計思路。納豆激酶的分離純化粗提方法即是將發(fā)酵液或納豆浸提液離心取上清，用硫酸銨或乙醇沉淀，再經(jīng)離心除去上清液中的粘性物質(zhì)，離心后取沉淀，溶于緩沖液中即為粗酶液。這個誘導表達系統(tǒng)稱為NICE系統(tǒng)。最后優(yōu)化培養(yǎng)條件，最終得到商品化的納豆激酶產(chǎn)品。 B. subtilis中最主要的蛋白質(zhì)分泌途徑，可以分為3個功能階段：①蛋白定位：分泌蛋白首先由核糖體合成前體，前體蛋白在N端含有信號肽；細胞質(zhì)分子伴侶可以幫助前體蛋白保持能夠被遷移的狀態(tài)； SRP與信號肽相互識別，將前體定位于膜上的Sec易位酶復合物。分泌蛋白至培養(yǎng)基、細胞壁及插入蛋白至細胞質(zhì)膜。前體蛋白可以通過Tat蛋白復合物(Tat易位酶)組成的通道而穿過細胞質(zhì)膜； 216。l pseudopilin export pathway: 感受態(tài)形成相關(guān)。Vip與Sip毒素都顯示了對一些鞘翅目昆蟲的殺蟲活性。谷氨酸生物合成途徑以及代謝途徑：谷氨酸生物合成：三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生α酮戊二酸，當αKGA（ α酮戊二酸）脫氫酶酶活性微弱或喪失時， α酮戊二酸會在NADPH和NH4+ 在谷氨酸脫氫酶作用下，合成谷氨酸，而不會生成琥珀酸，脫離三羧酸循環(huán)而生成谷氨酸，最后透過細胞膜分泌到胞外。 l 谷氨酸產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH氧化能力欠缺或喪失：NADPH是αKGA還原氨基化生成谷氨酸的必須物質(zhì)，該還原氨基化所需要的NADPH與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián)。糖的代謝才能沿著α 酮戊二酸的方向進行, 從而有利于谷氨酸的積累。l NH4+濃度： 影響到發(fā)酵液的pH值 與產(chǎn)物的形成有關(guān)：NH4+過量，菌體增殖階段會抑制菌體生長，產(chǎn)酸階段 Glu會受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（ Gln） NH4+不足，不利于α KGA的還原氨基化， α酮戊二酸積累，引起反饋調(diào) 節(jié)。l 生物素：當生物素過量時,菌體生長繁殖快,谷氨酸合成途徑受阻,發(fā)酵液中由菌種細胞排出的谷氨酸僅能占氨基酸總量的12%；生物素適量時,菌體代謝失調(diào),細胞膜通透性增強,細胞內(nèi)的谷氨酸能及時排出,有利于谷氨酸的積累。若溫度過高,菌體易衰老, 生產(chǎn)中表現(xiàn)為O D值增長慢, 耗糖慢, pH值高, 最終發(fā)酵周期長,產(chǎn)酸少。 l 泡沫 ：谷氨酸發(fā)酵是好氣性發(fā)酵, 因通風和攪拌產(chǎn)生泡沫是正常的, 但泡沫過多會帶來一系列問題: (1) 泡沫形成泡蓋時, 代謝產(chǎn)生的氣體不能及時排出,妨礙菌體呼吸作用,影響菌體的正常代謝。 （也就是說谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征 ：α酮戊二酸氧化能力微弱:；α酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低；谷氨酸脫氫酶活性強；還原性輔酶Ⅱ(NADPH+H+)進入呼吸鏈能力缺陷或微弱；異檸檬酸裂解酶活力微弱；不利用谷氨酸；耐高糖耐高谷氨酸 ；CO2固定能力強； 解除谷氨酸反饋抑制；具有向胞外分泌谷氨酸的能力.） 基因組信息：谷氨酸棒桿菌的碳代謝及氨基酸合成系統(tǒng)構(gòu)建 ：l 糖吸收 ：PTS系統(tǒng)：葡萄糖、果糖、甘露糖以及蔗糖 果糖攝取的PTS系統(tǒng)相關(guān)基因： ptsIcg2118pf