【正文】 激動(dòng)劑時(shí)，G蛋白的3個(gè)亞基呈聚合狀態(tài)，α亞基與GDP結(jié)合。配體結(jié)合在α亞基部位，β亞基具有內(nèi)在的酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性。 14 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） ：G1晚期的限制點(diǎn)、G1S轉(zhuǎn)折、G2M轉(zhuǎn)折、MG1有絲分裂關(guān)卡。進(jìn)入S期的細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)cyclin A并結(jié)合活化Cdk2，啟動(dòng)DNA復(fù)制。 十七、抑癌基因在細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制與腫瘤發(fā)生機(jī)制之間的關(guān)系 ：RB的作用機(jī)制是通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子E2FDP1結(jié)合，控制細(xì)胞無(wú)法通過(guò)G1S關(guān)卡。其另一個(gè)靶基因GADD45編碼DNA修復(fù)蛋白，與p21共同作用使受損細(xì)胞不再分裂，并修復(fù)損傷維持基因組穩(wěn)定。 2）負(fù)調(diào)節(jié)：①FLIP抑制caspase 8前體的活化；②Bcl2家族中抗凋亡成員阻斷促凋亡成員；③胞漿中存在的能抑制caspase的凋亡抑制物（IAP）。該載體應(yīng)具有：①有自己的復(fù)制子；②有多克隆位點(diǎn)；③具有可供選擇的遺傳標(biāo)記；④有足夠的容量；⑤可通過(guò)特定的方法導(dǎo)入宿主菌；⑥配備與大腸桿菌相適宜的完整表達(dá)盒，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄子、SD序列等。（如：?jiǎn)?dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)，終止信號(hào)，SD序列等） 二十二、逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)缺點(diǎn) ：1）高效地感染分裂的宿主細(xì)胞（100％）；2）在感染后，能將前病毒基因組穩(wěn)定地整合到宿主基因組的隨機(jī)位點(diǎn)上；3）利用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒能將目的基因傳遞給整個(gè)細(xì)胞群；4）宿主范圍廣，可以感染多種人和宿主細(xì)胞；5）不產(chǎn)生任何有免疫原性的病毒蛋白，對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒性作用，可建立細(xì)胞系長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)外源基因。另外在治療帕金森氏綜合癥,杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良,肺囊狀纖維化等疾病方面也有良好的應(yīng)用前景。 2. 基因敲除模型的應(yīng)用 基因敲除（gene knockout）是目前在體內(nèi)研究基因功能的最佳方法，指通過(guò)DNA同源重組定向地將外源基因替換宿主細(xì)胞染色體DNA中特定的基因，從而使特定的基因在細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi)失活的過(guò)程。 ，但表達(dá)發(fā)生改變→定量分析。 三十二、理想的基因治療載體具備的性質(zhì) ； 、充分及持續(xù)的外源基因表達(dá)； ； ； 。 影響因素： 1. 引物設(shè)計(jì)： ①引物長(zhǎng)度： 一般為1530bp，常用20bp左右。 2. 酶及其濃度：不同酶活性、保真性、熱穩(wěn)定性和可擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不同。 6. 退火溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的重要因素，退火溫度可按Tm－（5～10℃）估算。應(yīng)用高分辨的聚丙烯酰胺電泳，結(jié)合高效放射自顯影技術(shù)便可直接讀出DNA序列。利用DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’外切酶活性和5’→3’聚合酶活性，在切口處將舊鏈切除，同時(shí)用標(biāo)記的dNTP按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新鏈，從而使原DNA分子上的部分核苷酸殘基被標(biāo)記的核苷酸取代。 四十、探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn) ：是目前應(yīng)用最廣泛的探針，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA再克隆到適當(dāng)載體，擴(kuò)增、純化后獲得。缺點(diǎn)：所帶標(biāo)記物少，非放射標(biāo)記時(shí)敏感度低。同時(shí)由于被轉(zhuǎn)移反義RNA是被保護(hù)的，可抵抗核酸酶的降解作用，提高轉(zhuǎn)移效率。如果多克隆位點(diǎn)有外源DNA片段插入，將使lacZ基因滅活，不能產(chǎn)生有活性的β半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈白色。 四十三、藍(lán)白篩選的原理 某些質(zhì)粒載體（如pUC系列）帶有大腸桿菌的β半乳糖苷酶基因（lacZ）前一部分片段，在lacZ基因區(qū)又另外插入了一段含多克隆位點(diǎn)的DNA序列。 ：1）利用特定受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移。 ：根據(jù)已知核酸序列，直接合成一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段作為探針。 ：在合成過(guò)程中直接加入標(biāo)記的核酸制成探針，也可以合成后再用末端標(biāo)記法標(biāo)記。 ：能降低核酸雜交的Tm值，使低溫條件下探針結(jié)合更穩(wěn)定； ：指反應(yīng)體系中不同序列的總長(zhǎng)度，復(fù)雜性越高，雜交越容易； ：雜交前應(yīng)對(duì)非特異性雜交反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉。在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止位置間的距離。4種dNTP要等摩爾濃度配制，以減少PCR反應(yīng)的錯(cuò)配誤差并提高使用效率。 ⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。PCR全過(guò)程每一步的轉(zhuǎn)換是通過(guò)溫度的改變來(lái)控制的。 ：基因標(biāo)記實(shí)驗(yàn)是基因治療的前奏，并不在于直接治療疾病而是期望能夠提供有關(guān)正常細(xì)胞生物學(xué)和疾病病理方面的信息。且基因化學(xué)本質(zhì)是核酸，較蛋白質(zhì)樣本穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存，對(duì)原始樣本要求不高，污染的也可檢測(cè)； 、早期的診斷技術(shù)：只需幾個(gè)小時(shí)就可作出診斷，在疾病未表現(xiàn)癥狀的情況下便可進(jìn)行準(zhǔn)確的早期診斷； ：1）在基因水平對(duì)疾病的早期診斷；2）對(duì)家族性遺傳病進(jìn)行預(yù)警診斷；3）對(duì)有遺傳病家族史并攜帶致病基因或疾病相關(guān)基因的胎兒做產(chǎn)前診斷；4）確定與疾病有關(guān)聯(lián)的狀態(tài)，如對(duì)疾病易感性、發(fā)病類型、發(fā)展階段、是否具有抗藥等進(jìn)行分析；5）診斷體外不易培養(yǎng)的病原體（HIV、HBV）并進(jìn)行基因分型。 2）利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型研究特定基因：通過(guò)將目的基因轉(zhuǎn)移入細(xì)胞中，建立細(xì)胞模型，以研究目的基因的功能。 ：AAV載體在多種組織都進(jìn)行了成功的轉(zhuǎn)染,如肝、腦、心肌、骨骼肌、視網(wǎng)膜和氣 18 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 道上皮等組織未發(fā)現(xiàn)對(duì)機(jī)體有致病性。 （融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)：①穩(wěn)定，不易被細(xì)菌蛋白酶水解；②可產(chǎn)生分泌型產(chǎn)物；③可利用針對(duì)融合蛋白原核部分的單抗進(jìn)行親和層析，便于純化；④原核蛋白部分可用蛋白酶切除，釋放真核蛋白） 4）選擇適當(dāng)?shù)氖荏w菌株和誘導(dǎo)條件：根據(jù)啟動(dòng)子類型和特定蛋白質(zhì)選擇表達(dá)效率高的菌株。 主要應(yīng)用：1）對(duì)雙鏈DNA 3’突出末端進(jìn)行末端標(biāo)記；2）第二cDNA鏈合成；3）Sanger 測(cè)序；4）隨機(jī)引物法標(biāo)記法 DNA聚合酶：具有DNA依賴的5’→3’聚合酶活性、5’→3’外切酶活性、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性（3’加尾）、逆轉(zhuǎn)錄酶活性。 （線粒體釋放細(xì)胞色素C的3種模式：①Bax和Bak在線粒體外膜上打孔；②通過(guò)線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）；③它們使線粒體外膜上天然存在的ATPADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白孔道保持開(kāi)放，使細(xì)胞色素C從線粒體外膜間隙進(jìn)入胞漿） 進(jìn)入胞漿的細(xì)胞色素C與Apaf ATP/dATP結(jié)合形成凋亡體→Apaf 1通過(guò)胱天蛋白酶募集域（CARD）與caspase 9前體的CARD作用募集caspase 9前體→富集的caspase 9自我激活→激活caspase 3 →細(xì)胞凋亡。 : p53蛋白是核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，其一個(gè)重要的靶基因編碼p21蛋白。M期的cyclinA/BCdk1可使結(jié)合在紡錘體處的APC磷酸化而活化，最終導(dǎo)致連接染色體的蛋白質(zhì)降解。P53可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期抑制物p21蛋白的表達(dá)，阻止受損細(xì)胞通過(guò)G1S關(guān)卡。 十六、細(xì)胞周期的調(diào)控 細(xì)胞周期的調(diào)控主要是多蛋白參與的，針對(duì)細(xì)胞周期四個(gè)主要關(guān)卡的調(diào)控過(guò)程。 當(dāng)生長(zhǎng)激素抑制素等與相應(yīng)受體結(jié)合可結(jié)合偶聯(lián)αiG蛋白，αi亞基可直接抑制AC活性，同時(shí)游離的βγ亞基可與αs亞基結(jié)合抑制對(duì)AC的活化作用，使AC活性下降。 同時(shí)，α亞基水解GTP為GDP，然后α亞基GDP復(fù)合物重新與βγ亞基結(jié)合形成無(wú)活性的三聚體，完成一次信息傳導(dǎo)。 ：高度特異性、高親和力、可飽和性、可逆性、放大效應(yīng)。 ： 1）反式作用因子活性的調(diào)節(jié)：①表達(dá)調(diào)節(jié)－合成出來(lái)就有活性；②共價(jià)修飾－磷酸化、去磷酸化、糖基化；③配體結(jié)合－許多激素受體是反式作用因子；④蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用－復(fù)合物的解離與形成。緊靠螺旋區(qū)N端有一段富含堿性氨基酸的序列可與DNA結(jié)合。由于細(xì)菌轉(zhuǎn)錄翻譯偶聯(lián)，當(dāng)細(xì)胞中有色氨酸時(shí)可以形成色氨酰tRNA，核糖體可迅速通過(guò)相鄰兩個(gè)色氨酸位點(diǎn)，封閉片段2，致使片段4 10 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，終止轉(zhuǎn)錄。 七、色氨酸操縱子的作用機(jī)制 色氨酸操縱子（trp operon）是一種阻遏型操縱子，含E、D、C、B、A五個(gè)結(jié)構(gòu)基因，編碼色氨酸合成相關(guān)酶。 六、乳糖操縱子的作用機(jī)制 乳糖操縱子（lac operon）含Z、Y、A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β半乳糖苷酶、透酶、乙?；D(zhuǎn)移酶。 1）錯(cuò)義突變：因?yàn)镈NA分子中堿基的取代，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄翻譯后蛋白質(zhì)氨基酸組成和排列順序發(fā)生改變。 ：如吖啶類化合物的插入，生物氧化的自由基與DNA發(fā)生加成和小自由基反應(yīng)等。 6 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 問(wèn)答題 一、病毒、原核、真核基因組的特點(diǎn) 1）病毒基因組較小，是單倍體； 2）形式多樣：病毒基因組有的是DNA，有的是RNA，但只含一種核酸。G蛋白具有結(jié)合GDP或GTP的能力，并有催化GTP成GDP的活性，廣泛存在各種組織細(xì)胞膜上，在受體和效應(yīng)蛋白間起傳遞信息的作用。 61. PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）：PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻挠捎跇?gòu)象的不同因而遷移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在，常用于點(diǎn)突變的檢測(cè)?？梢宰鳛榛虮磉_(dá)和病毒復(fù)制的抑制劑。 49. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：是指基因組中整合有人工導(dǎo)入的外源基因、外源基因能夠表達(dá)并按孟德?tīng)柖蛇z傳的一類動(dòng)物。端粒DNA由短的高度重復(fù)序列組成，重復(fù)序列在DNA復(fù)制過(guò)程中正常復(fù)制，部分由端粒酶延伸。 38. 轉(zhuǎn)化（transformation）：質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。當(dāng)這類基因發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)，可以引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。當(dāng)癌基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)發(fā)生異常時(shí)，其產(chǎn)物可以使細(xì)胞無(wú)限制增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。可在細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和噬菌體基因組之間轉(zhuǎn)移，是細(xì)菌耐藥基因播散的機(jī)制。 20. 啟動(dòng)子：是RNA聚合酶特異識(shí)別和結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列。 13. 基因工程：有目的地通過(guò)分子克隆技術(shù)，利用克隆基因表達(dá)、制備特定的蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物，或定向改造基因結(jié)構(gòu)的系列過(guò)程。微衛(wèi)星DNA因?yàn)橹貜?fù)單位的重復(fù)次數(shù)不同而具有高度的遺傳多態(tài)性，并且按照孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，可以作為很好的遺傳標(biāo)記。 3. 結(jié)構(gòu)基因：基因中編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列，包括模板鏈和編碼鏈。 6. 非編碼區(qū)（UTR）：是位于開(kāi)放閱讀框的5’端上游和3’端下游的沒(méi)有編碼功能的核苷酸序列。 10. 反向重復(fù)序列：是指兩個(gè)順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列。 16. 功能基因組學(xué)：研究基因組中的所有基因功能的學(xué)科，是從基因整體水平上對(duì)基因的活動(dòng)規(guī)律進(jìn)行探討。 22. 衰減子（attenuator）：位于一些操縱子中第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之前的一段能夠減弱轉(zhuǎn)錄作用的DNA序列。該序列能與核糖體30s小亞基中16s rRNA 3’端 2 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 富含…UCCU…序列互補(bǔ)，是核糖體特異識(shí)別和結(jié)合的部位。在正常細(xì)胞內(nèi)未激活的癌基因叫原癌基因，當(dāng)其受到某些條件激活時(shí)，結(jié)構(gòu)和表達(dá)發(fā)生異常，能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 36. 周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDK）：是一類可以與周期蛋白結(jié)合，并將周期蛋白作為其調(diào)節(jié)亞單位，進(jìn)而表現(xiàn)出蛋白激酶活性的蛋白質(zhì)。 41. 感染：以噬菌體、粘粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，進(jìn)而感染適當(dāng)細(xì)胞并在其內(nèi)擴(kuò)增的過(guò)程。） 46. 順式作用元件（cisacting element）：是指那些與結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)，能夠被基因調(diào)控蛋白特異識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。 52. 蛋白磷酸酶：具有催化已經(jīng)磷酸化蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類酶分子，與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在，共同構(gòu)成磷酸化與去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開(kāi)關(guān)系統(tǒng)。 57. 基因診斷：以DNA和RNA為診斷材