【正文】 并且為我們提供了一些預(yù)防和治療真菌的可能的途徑，有待于我們來思考。老師講授的CRISPR技術(shù)也是目前計較熱的基因組編輯技術(shù)，是我們對這項技術(shù)有個比較詳盡的了解。 古菌方面，向老師為我們講授了古菌，它有一個原核的外表，卻有著一個真核的內(nèi)心，這句話涵蓋了古菌的基本遺傳特征。 這部分內(nèi)容我覺得對我?guī)椭畲蟮膽?yīng)該是大腸桿菌，它是一種生物技術(shù)載體，幾乎每個分子生物學(xué)實驗室都在使用的一種細(xì)菌，包括我們實驗室。 大腸桿菌,芽孢桿菌,乳酸菌方面，鐘老師為我們講授了模式生物的遺傳與分子生物學(xué)技術(shù)。并且，通過本課程的學(xué)習(xí)，我們可以運用老師所教授的分子生物學(xué)技術(shù)來進(jìn)行我以后課題的研究。 首先，鏈霉菌方面，譚老師和劉老師的研究部分是鏈霉菌（放線菌）的遺傳特性以及次生代謝的分子調(diào)控以及其遺傳基礎(chǔ)與操作知識。Mac1也可以調(diào)控白念珠菌細(xì)胞死亡。我們可以利用這項法則來治療和預(yù)防真菌疾病。白色念珠菌可以通過遮掩betaglycan來逃避和抵抗免疫系統(tǒng)的攻擊，使暴露betaglycan即可激活免疫反應(yīng)，從而治療真菌疾病。因此我們可以抑制其形成生物被摸，從而講授真菌的抗藥性并且使其致病性被減弱或消除。獨特的生物學(xué)特征超強的宿主環(huán)境適應(yīng)能力：形態(tài)轉(zhuǎn)換、有性生殖、毒性因子、生物被膜、宿主微環(huán)境適應(yīng)、念珠菌宿主互作、藥物及耐藥、基因組及基因組穩(wěn)定性l 因此，我們可以不殺死真菌，而只是抑制其菌絲的生長來削弱其侵染人體的能力，同時能夠避免真菌產(chǎn)生抗藥性。 有超強的適應(yīng)宿主微環(huán)境的能力！怎樣預(yù)防和治療白色念珠菌和其他真菌引起的疾病？l 通過認(rèn)識白色念珠菌的生物學(xué)特征，減少感染機會；有超強的適應(yīng)宿主微環(huán)境的能力：高溫環(huán)境適應(yīng)（≥37176。成功致病菌的四個特征：（≥37176。在特定的條件下，細(xì)菌可以形成生物被膜，包被有生物被膜的細(xì)菌稱為被膜菌。意義：（1）在兩種形態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)之間建立了聯(lián)系；（2）暗示白念珠菌形態(tài)發(fā)生可能有更強的可塑性及宿主環(huán)境適應(yīng)能力?；揖z細(xì)胞能進(jìn)行高效率交配。平衡了種群長期進(jìn)化與短期快速環(huán)境適應(yīng)的之間的矛盾 以最經(jīng)濟節(jié)約的方式達(dá)到目的。 ‘‘Cost of males’’ ；b. 有性繁殖慢于無 性繁殖； … 2. 2. 適當(dāng)時候，促進(jìn)有性生殖。1. 限制有性生殖，white細(xì)胞中完全關(guān)閉交 配相關(guān)生物學(xué)過程。White cells 可以促進(jìn) opaque cells交配。只有a/a 和alpha/alpha菌株 能進(jìn)行白 灰轉(zhuǎn)換；只有灰菌能進(jìn)行高效率交配。CO2感應(yīng)研究將揭示白念珠菌宿主環(huán)境 適應(yīng)和感染的機制。宿主微環(huán)境適應(yīng)：（(1)念珠菌為什么要進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換？ (2)念珠菌為什么能進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換 (尤其是共生或感染過程中) ？）宿主環(huán)境特征：復(fù)雜和易變 相對高溫（37 186。WOR1是調(diào)控Whiteopaque轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵基因。形態(tài)轉(zhuǎn)換：白色念珠菌形態(tài)多樣性，具有兩種典型的形態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)即White和 Opaque。第6章 ：2為什么白色念珠菌是人體內(nèi)最成功的共生菌和致病菌？白色念珠菌 是如何適應(yīng)宿主環(huán)境的，它的獨特的生物學(xué)特征是如何進(jìn)化出來的？ 認(rèn)識白色念珠菌的生物學(xué)特征。這種方法需要設(shè)計多一倍的靶向sgRNAs，雖然會減少脫靶率，但是多個sgRNAs 也可能引起復(fù)雜的組合型DNA 片段編輯。同時相對于普通質(zhì)粒來說，作用是時間也比較長，可以達(dá)到更理想的敲除效果。 雖然普通質(zhì)粒很多時候也能達(dá)到實驗效果，但是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有效率低，作用時間短暫性等缺點。總之，CRISPRCas9是細(xì)菌的一種“獲得性免疫系統(tǒng)”。自CRISPR 技術(shù)出現(xiàn)以來，因其高效、便捷、易操作等特性，已有不少科研團(tuán)隊將其應(yīng)用于染色體易位的相關(guān)研究。在不同的染色體上引入同時出現(xiàn)的DSBs 是引發(fā)染色體易位必不可少的環(huán)節(jié)之一。染色體靶向易位：染色體易位常常與腫瘤發(fā)生有著密不可分的關(guān)系，因此染色體易位的研究對于人們認(rèn)識腫瘤的發(fā)病機理尤為重要。盡管利用CRISPR/cas9 系統(tǒng)進(jìn)行DNA 片段靶向重復(fù)研究才剛剛起步，效率還有待提高。DNA 片段靶向重復(fù)：在小鼠中能夠通過基因打靶和跨等位基因重組的方法獲得靶向DNA片段重復(fù)，但操作難度大，且效率偏低。DNA 片段靶向反轉(zhuǎn)：吳強團(tuán)隊在哺乳動物細(xì)胞和小鼠中對DNA 片段反轉(zhuǎn)進(jìn)行了詳盡的研究。2013 年，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被應(yīng)用到哺乳動物細(xì)胞中，張鋒團(tuán)隊和Church 團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)位于同一條染色體上的兩個sgRNAs 對DNA 雙鏈進(jìn)行操作時，在獲得定點突變的同時，也存在DNA 片段刪除的情況。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組DNA 片段靶向編輯方面的研究和應(yīng)用，主要包括DNA 片段的刪除、反轉(zhuǎn)、重復(fù)、插入和易位，這一有效的DNA 片段編輯方法為研究基因功能、調(diào)控元件、組織發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展提供了有力手段。由于它具有設(shè)計簡單，容易操作和成本低廉等重要優(yōu)勢，全世界生物學(xué)實驗室都可以利用它去進(jìn)行基因編輯研究。））l CRISPRCas9技術(shù)應(yīng)用策略特點： 1)以RNADNA配對為基礎(chǔ)，可在多位點同時編輯 2)通過對Cas9活性修飾，可以拓展適用范圍。它是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。 l 理解為什么不受控制原生適應(yīng)必需被沉默掉的客觀實事: 傷害宿主。利用該機制，對發(fā)生突變的病毒也可迅速獲取新的spacer, 重啟干擾過程。l 在一定程度上為回答CRISPR適應(yīng)過程如何區(qū)分異己DNA提供了線索。l 回答了Nature (2012)關(guān)于CRISPR適應(yīng)的第一個關(guān)鍵問題，即為什么很難觀察到實驗室菌株CRISPR對特定天然病毒的適應(yīng)過程（因通常缺乏引發(fā)spacer)。適應(yīng)過程需要被某一spacer引發(fā)至同源的外源DNA。 捕獲Target RNA時需要Cmr1和6；Cmr4行使切割活性 。Cas3然后會在任意方向沿著DNA作為spacer獲得復(fù)合體的一部分。 依賴PAM 過程需要 Cas1Cas2 來募集 Cas3。CRISPR高效的“引發(fā)適應(yīng)”過程及可能的機制：引發(fā)適應(yīng)過程（I型CRISPR)具有高效性和特異性，需要所有的Cas蛋白參與和一個引發(fā)型crRNA。 CRISPRCas作用過程與機制 ：分為三步：第一步 新spacer獲取 新的spacers 被整合到開始的部位,而原來的 spacers 則被置于后端。 嗜熱古菌研究意義：嗜熱古菌的研究對生命科學(xué)的貢獻(xiàn) ：嗜熱古菌具有特殊的機制（如正超螺旋）穩(wěn)定其基因組；同時具有熱穩(wěn)定蛋白，因此是耐熱蛋白和工具酶的很好的來源，如應(yīng)用于PCR的Pfu酶。 3) 嗜鹽古菌是地球上生命進(jìn)化的一個獨特分支，即所有極端嗜鹽古菌處于同一個綱，但同時基因組存在廣泛多樣性，是研究物種形成和演化的重要材料。 2) 嗜鹽古菌具有獨特的鹽適應(yīng)機制和功能物質(zhì)，因其制備的方便性和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展和生物技術(shù)的進(jìn)步起到了重要的推動作用。 b. 甲烷古菌的發(fā)現(xiàn)對生命科學(xué)的貢獻(xiàn) ：1906年Beijerinck實驗室描述了第一個甲烷菌Methylomonas methanica。 l 高溫古菌：易于生化分析，但平板培養(yǎng)及遺傳操作較困難，還需研發(fā)合適的抗生素標(biāo)記等。 l 嗜鹽古菌：中溫培養(yǎng)，好氧，原生質(zhì)體較好制備，容易遺傳轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒豐富，但胞內(nèi)高鹽，需研發(fā)自己的遺傳操作體系。模式古菌及其遺傳操作系統(tǒng)的特色 :相對于細(xì)菌，古菌在遺傳信息處理系統(tǒng)方面與真核生物同源，代表古菌真核生物進(jìn)化分支的基本特性。通過組合基因敲除確定HFX1023和HFX6004功能； 通過對4基因敲除進(jìn)行互補，確定了HFX1022和HFX6003功能； 這是在所有生物中首次發(fā)現(xiàn)具大小亞基結(jié)構(gòu)的PHA合成特異的β酮硫解酶。生物信息分析表明, 地中海富鹽菌編碼8種β酮硫解酶同源蛋白；但單獨基因敲除后仍能合成PHA；推測存在功能冗余、PhaA和BktB由不同基因編碼。但是若突變株只是該基因編碼的物質(zhì)減少，但不會過多影響其代謝及生命活動，那么可以說該基因是重要的。若該基因敲除后，單獨敲除該目標(biāo)基因的突變株仍然能夠合成該物質(zhì)，那么可以說明，該基因編碼的物質(zhì)可以由多種途徑合成或者有編碼該產(chǎn)物的同源基因，說明該基因是非必需的，否則該基因可能是重要的或者必不可少的。2 如何設(shè)計基因敲除等相關(guān)實驗分別證明一個基因是非必需的，是重要的，或者是必不可少的？ 證明一個基因是非必需還是重要的還是必不可少的，首先就要構(gòu)建一個敲除載體，先把該目的基因敲除。以古菌的基因組復(fù)制為例：1　 所需的元件：復(fù)制模板、引物、DNA聚合酶、解鏈酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA連接酶拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA連接酶2　 復(fù)制過程中各元件的配合過程：起始：復(fù)制起點的識別，解旋酶加載，解鏈；延伸：單鏈DNA被單鏈結(jié)合蛋白保護(hù)，引發(fā)物合成引物，引物通過DNA聚合酶延伸前導(dǎo)鏈后隨練合成岡崎片段，滑夾裝載蛋白RFC通過與引發(fā)物合物及PCNA的互作協(xié)調(diào)DNA聚合酶在后隨鏈上的重復(fù)裝載及鏈延伸；Fen1以及l(fā)igase完成引物處理以及岡崎片段連接。l ，感知胞內(nèi)外環(huán)境的變化是極其重要的特征（大家可以就不同類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子舉例），本例中PhaR通過感應(yīng)PHA顆粒上的空間而調(diào)節(jié)對phaRP啟動子區(qū)的結(jié)合，從而同時調(diào)節(jié)PHA顆粒關(guān)鍵蛋白PhaP和自身的表達(dá)，確保了PHA顆粒的有序形成；因此在地中海富鹽菌中，PhaR在其PHA積累和顆粒形成中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。l ：GTF: 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,Phsp5是嗜鹽古菌NRC1中熱誘導(dǎo)最強的啟動子。l 調(diào)控因子：轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要發(fā)生在起始位點和起始階段:任何步驟被阻止都可抑制基因表達(dá)；任何步驟被強化都可能增強基因表達(dá)。l 啟動子核心序列：TATA box (中心通常位于－25)，結(jié)合TBP, 富含AT；決定啟動子活性BRE元件 (緊臨TATA box上游)，結(jié)合TFB, 富含嘌呤；決定轉(zhuǎn)錄方向l 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子: TATAbox binding protein (TBP)Transcription Factor B (TFB, 與真核?生物物TFIIB類似）l RNA聚合酶(RNAP): 真核類型，有1113個亞基古菌RNAP與真核生物類似，與細(xì)菌很不一樣： DLNP提供平臺以結(jié)合Ａ’A”B’B”形成活性位點；K對上述活性有增強作用(K可與TFB互作，但并非必不可少）；H增加對啟動子的特異活性；EF為RNAP結(jié)構(gòu)組成，但非活性必須。真核型復(fù)制機器比古菌更復(fù)雜，主要原因是有更多生理過程需要協(xié)調(diào)，其核心蛋白與古菌同源，與細(xì)菌不同。這樣的鹽類物質(zhì)組合讓這種鹽水得以有可能在火星表面穩(wěn)定存在足夠長的時間，所以推測可能有嗜鹽微生物的存在。這些鹽類的主要成分是高氯酸鎂、氯酸鈉和一些氯化物。而此次的最新研究確認(rèn)其形成與含鹽的液態(tài)水體流動有關(guān)。因此可能會存在熱泉，所以推測火星上可能會有極端嗜熱古菌和嗜熱酸古菌存在。而火星上的液態(tài)水存在，并且項目科學(xué)家報告說，“勇氣”號正在探索古謝夫環(huán)形山區(qū)域的“赫斯本德山”。l 在地球各種極端自然環(huán)境中生活的古菌，又稱為極端古菌。它們能在無氧、無陽光的條件下生存，借助化學(xué)反應(yīng)的能量或地?zé)岬刃玛惔x，甲烷是其代謝產(chǎn)物。這種能在極端嚴(yán)酷條件下生存的微生物有可能在火星上生存。因此，我推測火星上機油可能存在光合細(xì)菌。直到地球上進(jìn)化出了光合細(xì)菌，才產(chǎn)生了足夠的氧氣，從而進(jìn)化出動物。地球最初形成時并不存在氧氣，看起來也是一片荒涼的不毛之地。l 火星大氣層構(gòu)成：%的二氧化碳、%的氮、%的氬、%的氧。在地球上主要生活于海水曬鹽場，鹽湖，以及腌制食品；可生活于高鹽(4M)甚至飽和鹽濃度，產(chǎn)菌紅素和紫膜可使鹽場或鹽湖變紅；主要為好氧異氧生活，主要利用氨基酸，不能利用葡萄糖；可通過紫膜利用光能產(chǎn)ATP和發(fā)酵精氨酸產(chǎn)ATP； 具有強的抗輻射能力。 而溫度極限兩級極有可能是古菌存在。如果真的存在，可能會是什么類型的極端微生物？ l ℃，℃，℃。l 基因組：高G+C (6070% ), 結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定； 多復(fù)制子及多復(fù)制起始位點，基因組復(fù)制穩(wěn)定性 ；每個復(fù)制子多拷貝，生理調(diào)節(jié)及抗損傷的適應(yīng)性 ；l 特殊代謝途以上的分子生物學(xué)特性使得極端嗜熱古菌成為地球上最耐熱的生命形式。 哪些分子生物學(xué)特性使極端嗜熱古菌成為地球上最耐熱的生命形式？l 細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特殊：一般的真菌和細(xì)菌的細(xì)胞膜是酯鍵，100℃ 以上細(xì)菌細(xì)胞膜損毀，古菌細(xì)胞膜更穩(wěn)定，是醚鍵，而甘油與異戊二烯衍生物組成的醚鍵更加穩(wěn)定，因此細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定使得極端嗜熱古菌成為地球上最耐熱的生命形式。該技術(shù)主要有三個步驟：首先是基因組DNA的獲得，其次是16S rRNA基因片段的獲得，最后是進(jìn)行16S rRNA基因序列的分析。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)及核酸研究技術(shù)的不斷完善，16S rRNA基因檢測技術(shù)已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。16S rRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中。l 與23S進(jìn)行交互，幫助兩個核糖體子單元的結(jié)合。16S rRNA的339。l 339。細(xì)菌的16S rRNA含有1540個核苷酸，相對分子質(zhì)量適中，很適合研究菌株分類進(jìn)化。第五章 古菌1 16S rRNA的功能機制是什么？ 細(xì)菌含有的核糖體分為23S，16S和5S rRNA 3種類型，其分子由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成，其中某些堿基序列在相當(dāng)長期的進(jìn)化過程中保持恒定。羊毛硫細(xì)菌素的生物合成基因簇的組成：參與羊毛硫細(xì)菌素合成的基因一般位于一個基因簇中，簇中基因一般包括羊毛硫細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因，修飾基因，轉(zhuǎn)運加工蛋白基因、免疫蛋白基因及調(diào)控蛋白基因。 l 基因組中有很多插入序列 ：乳酸菌基因組中中含有轉(zhuǎn)座因子插入序列(IS)，大小一般在7502500bp，%到乳酸乳球菌乳脂亞種的5%，說明這些菌有較高的遺傳可塑性。l 基因組中都含有假基因 ：所有的乳酸菌都含有假基因且數(shù)目變化很大，如在腸膜明串珠菌中20個，嗜熱鏈球菌含有200個假基因。1