【正文】 單色器 、 檢測器等組成 2022/4/14 在設(shè)計(jì)磷光光度計(jì)時(shí)應(yīng)考慮到下面兩個(gè)因素： ? 試樣需在液氮下 （ 77K） 分析 ， 以減小猝滅效應(yīng)的影響 ? 激發(fā)必須按時(shí)開關(guān) ， 以在無熒光的情況下觀察磷光發(fā)射 2022/4/14 光學(xué)系統(tǒng)與熒光分光光度計(jì)的區(qū)別 光源 樣品池 激發(fā) 單色器 檢測器 數(shù)據(jù)處理 儀器控制 發(fā)射 單色器 切光器（斬波器） 共振熒光： 1012 sec 熒 光： 108 sec 磷 光： 1~104 sec 遲滯熒光： 100~104 sec 樣品池與熒光分光光度計(jì)的區(qū)別 樣品池需要放在盛 液氮的石英杜瓦瓶 內(nèi)，來測定 低溫磷光 2022/4/14 2022/4/14 ? 斬波片 步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)的兩個(gè)斬波片用于區(qū)分磷光與熒光，一個(gè)在激發(fā)光單色器和液槽之間，另一個(gè)在液槽和發(fā)射光單色器之間。同相時(shí)，測到的是磷光與熒光的總光強(qiáng)；異相時(shí)，激發(fā)光被遮斷。熒光壽命短，立即消失，而磷光壽命長，故測到的僅為磷光。調(diào)節(jié)兩個(gè)斬波片的轉(zhuǎn)速，可測出不同壽命的磷光 2022/4/14 磷光鏡示意圖 2022/4/14 （ 三 ） 分析方法及應(yīng)用 ? 一般與熒光分析相同 ， 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法 ? 與熒光分析法相似 ， 磷光分析法在有機(jī) 、生物 、 醫(yī)藥及臨床檢驗(yàn)等各個(gè)領(lǐng)域中得到了應(yīng)用 。 它與熒光法互相補(bǔ)充 ， 成為痕量有機(jī)分析的重要手段 2022/4/14 1． 稠環(huán)芳烴和石油產(chǎn)物的分析 2． 農(nóng)藥 、 生物堿和植物生長激素的分析 3． 藥物分析和臨床分析 4． 應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)的研究 ? 磷光分析法在無機(jī)物質(zhì)測定中應(yīng)用很少 2022/4/14 化學(xué)發(fā)光與生物發(fā)光分析 一 、 概述 ? 化學(xué)發(fā)光（ chemiluminescence） 不是由光、熱或電能而是由化學(xué)反應(yīng)激發(fā)物質(zhì)所產(chǎn)生的光輻射 ? 某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)到激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)去激化躍回基態(tài)時(shí)以輻射形式發(fā)出一定波長的光。這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程，稱為化學(xué)發(fā)光。利用化學(xué)發(fā)光建立起來的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法 2022/4/14 ? 生物發(fā)光（ bioluminescence） 是指產(chǎn)生于生物體系中的化學(xué)發(fā)光 2022/4/14 化學(xué)發(fā)光與生物發(fā)光分析是借助于上述發(fā)光現(xiàn)象建立起來的 。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是： ① 靈敏度極高 ② 儀器設(shè)備簡單 ， 不需要光源及單色器等 ，也沒有散射光及雜散光等引起的背景值 ③ 線性范圍寬 ④ 分析速度快 2022/4/14 ⑤ 最適合與其它技術(shù) ， 如流動(dòng)注射 、 高效液相色譜和毛細(xì)管電泳等技術(shù)聯(lián)用 本法的局限性是： ① 可供發(fā)光用的試劑目前尚有限 ② 發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究 ③ 選擇性差 2022/4/14 二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理 產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的反應(yīng) ， 應(yīng)具備下述條件： （ 1） 化學(xué)反應(yīng)必須能放出足夠的能量 ，以引起電子激發(fā) 。 通常 ， 只有那些反應(yīng)速度相當(dāng)快的放 熱 反 應(yīng) ， 其 ΔH 介于 170—300KJmol1之間 ， 才能在可見光范圍內(nèi)觀察到化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象 2022/4/14 （ 2） 要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程 ， 以使所產(chǎn)生的能量用于不斷地產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子 （ 3） 激發(fā)態(tài)分子躍回基態(tài)時(shí) ， 要能釋放出光子 ， 而不是熱的形式消耗能量 2022/4/14 化學(xué)發(fā)光效率 ψCL可用下式表示： ψCL=發(fā)射光子數(shù) /參加反應(yīng)分子數(shù) = ψr● ψf （ ψr=激發(fā)態(tài)分子數(shù) /參加反應(yīng)分子數(shù)； ψf=產(chǎn)生光子數(shù) /激發(fā)態(tài)分子數(shù) ） ? 它取決于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)效率 ψr和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率 ψf這兩個(gè)因素 2022/4/14 ? 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度 ， 以單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示 ， 等于單位時(shí)間內(nèi)起了反應(yīng)的被測定的反應(yīng)物 A的濃度的變化 （ 以微分表示 ） 與化學(xué)發(fā)光效率 ψCL的乘積 ICL（ t） =ψCL?dcA/dt (8— 6) 2022/4/14 ? 在發(fā)光分析過程中，還有許多動(dòng)力學(xué)因素要考慮 ? 在合適的條件下，發(fā)光峰值與被分析物濃度成線性關(guān)系，可以用于進(jìn)行定量分析 2022/4/14 三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型 直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光 ? 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可分直接發(fā)光和間接發(fā)光 ? 直接發(fā)光是被測物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。表示如下 : ? 式中 A或 B是被測物 ， 通過反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物 C*， 當(dāng) C*躍遷回基態(tài)時(shí) ， 輻射出光子 2022/4/14 ? 間接發(fā)光是被測物 A或 B通過化學(xué)反應(yīng)后生成初始態(tài) C*， C*不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給 F， 使 F處于激發(fā)態(tài)，當(dāng) F*躍遷回基態(tài)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)光。如下式表示 ? 式中 C*為能量給予體，而 F為能量接受體 2022/4/14 ? 例如，用羅丹明 B－ 沒食子酸的乙醇溶液測定大氣的 O3， 其化學(xué)發(fā)光反應(yīng)就屬間接發(fā)光 ? 沒食子酸被 O3氧化時(shí)吸收反應(yīng)所產(chǎn)生的化學(xué)能，形成受激中間體 A*， 而 A*又迅速將能量轉(zhuǎn)給羅丹明 B， 并使羅丹明 B分子激發(fā)，處于激發(fā)態(tài)的羅丹明 B分子回到基態(tài)時(shí)，發(fā)射出光子。該光輻射的最大放射波長為 584nm 2022/4/14 氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光 ? 按反應(yīng)體系的狀態(tài)來分類 ? 如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行稱氣相化學(xué)發(fā)光 ? 在液相或固相中進(jìn)行稱液相或固相化學(xué)發(fā)光 ? 在兩個(gè)不同相中進(jìn)行則稱為異相化學(xué)發(fā)光 2022/4/14 （ 一 ） 氣相化學(xué)發(fā)光 ? 主要有 O NO、 S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) ， 可用于監(jiān)測空氣中的 O NO、 NO H2S、SO2和 CO等 2022/4/14 1． 臭氧的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) ? 這個(gè)氣相化學(xué)發(fā)光的最大波長為 435nm， 發(fā)光反應(yīng)對 O是特效的 ， 線性響應(yīng)范圍為 1ngcm3～－ 1μgcm3 2022/4/14 2． 氮氧化物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + hν 靈敏度： 1 ng/mL 測定范圍： ~10000 μg/mL 2022/4/14 3. 利用氧原子化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 氣相中的 SO2 、 NO、 NO2 及 CO等能與氧原子產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng) ， 如： CO + O CO2* CO2* CO2 + hν 2022/4/14 ? 發(fā)射光譜范圍為 300~500nm ? 測定靈敏度為 1 ng/mL ? 氧原子由 O3在 1000oC的石英管中分解為O2和 O所得 2022/4/14 4. 火焰化學(xué)發(fā)光 （ 1） 一氧化氮 （ 2） 揮發(fā)性硫化物 2022/4/14 （ 二 ） 液相化學(xué)發(fā)光 ? 常用于液相化學(xué)發(fā)光分析的發(fā)光物質(zhì)有 魯米諾、光澤精、洛汾堿、沒食子酸、吖啶酯類、釕聯(lián)吡啶配合物、過氧草酸鹽、硅氧烯和芳香族游離基離子等 ? 其中魯米諾（ Lominol） 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理研究得最久，其化學(xué)發(fā)光體系已用于測量痕量的HO以及 Cu、 Mn、 Co、 V、 Fe、 Cr、 Ce、 Hg和 Th等金屬離子。魯米諾是 3氨基苯二甲酰肼，它產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率為 ～ 2022/4/14 ? 魯米諾在堿性溶液中形成疊氮醌（ a），疊氮醌在堿性溶液中與氧化劑如 H2O2作用生成不穩(wěn)定的橋式六員環(huán)過氧化物中間體（ b）。 然后再轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)的氨基鄰苯二甲酸根離子（ c）， 其價(jià)電子從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級層躍遷回基態(tài)中各個(gè)不同振動(dòng)能級層時(shí)，產(chǎn)生最大發(fā)射波長為 425nm的光輻射 2022/4/14 整個(gè)反應(yīng)歷程可表示如下 2022/4/14 ? 以上的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率很慢，但某些金屬離子（如在本節(jié)開始所提到的金屬離子）會(huì)催化這一反應(yīng)，增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度。利用這一現(xiàn)象可以測定這些金屬離子 2022/4/14 ? 還可將分析物通過酶的轉(zhuǎn)化，生成化學(xué)發(fā)光反應(yīng)物，然后再進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度間接測定被分析物 ? 例如，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下進(jìn)行氧化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可通過魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行測定，從而間接測定葡萄糖 ? 氨基酸的測定 2022/4/14 H2O2使魯米諾發(fā)光 2022/4/14 ? 如果使酶促反應(yīng)的底物濃度一定，則上述反應(yīng)可用于酶測定或酶動(dòng)力學(xué)研究 2022/4/14 其他用于液相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光試劑 2022/4/14 （ 三 ） 電致化學(xué)發(fā)光 ? 由電解著的溶液所產(chǎn)生的光發(fā)射稱為電致化學(xué)發(fā)光 ? 電致化學(xué)發(fā)光是在化學(xué)發(fā)光的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分析方法 ， 它是化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)相互滲透的產(chǎn)物 2022/4/14 ? 與常規(guī)的化學(xué)發(fā)光法比較 ， 電致化學(xué)發(fā)光具有以下獨(dú)特的特點(diǎn)： 1) 由于發(fā)光物質(zhì)是在電極上產(chǎn)生的 ， 因此可以通過電極電位的控制及改變波形發(fā)生器所發(fā)出的波形 ， 達(dá)到控制化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程的目的 ， 提高分析的選擇性 ，并能為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理的研究提供更多有用的信息 2022/4/14 2) 具有極高的靈敏度和很寬的線性范圍 3) 一些特別不穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光試劑或中間產(chǎn)物可以在電極表面現(xiàn)場產(chǎn)生 ， 并盡快產(chǎn)生反應(yīng) 2022/4/14 4) 有可能用電化學(xué)的方法修飾某些無化學(xué)發(fā)光活性的化合物 ， 使之能直接參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng) ， 擴(kuò)大了化學(xué)發(fā)光法可檢測物質(zhì)的范圍 5) 易于與其它技術(shù) ， 如流動(dòng)注射 、 高效液相色譜和毛細(xì)管電泳等聯(lián)用 2022/4/14 四、化學(xué)發(fā)光的測量儀器 ? 按照進(jìn)樣方式，可將發(fā)光分析分為 分立取樣式和 流動(dòng)注射式 兩類 2022/4/14 （ 一 ） 分立取樣式 ? 分立式化學(xué)發(fā)光儀是一種在靜態(tài)下測量化學(xué)發(fā)光信號的裝置 ? 分立取樣式儀器具有設(shè)備簡單、造價(jià)低、體積小和靈敏等優(yōu)點(diǎn)，還可記錄化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的全過程，故特別適用反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究 2022/4/14 ? 但這類儀器存在兩個(gè)嚴(yán)重缺點(diǎn)： ? 一是手工加樣速度較慢，不利于分析過程的自動(dòng)化，且每次測試完畢后，要排除池中廢液并仔細(xì)清洗反應(yīng)池，否則產(chǎn)生記憶效應(yīng) ? 另一點(diǎn)是加樣的重復(fù)性不好控制，從而影響測試結(jié)果的精密度 2022/4/14 （ 二 ） 流動(dòng)注射式 ? 化學(xué)發(fā)光分析中 ， 被檢測的光信號只是整個(gè)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線的一部分 ， 以峰高來進(jìn)行定量分析 ? 此外 ， 要根據(jù)不同的反應(yīng)速度 ， 選擇試樣準(zhǔn)確進(jìn)到檢測器的時(shí)間 ， 以使發(fā)光峰值的出現(xiàn)時(shí)間與混合組分進(jìn)入檢測器的時(shí)間恰好吻合 ? 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析的分析性能比分立式化學(xué)發(fā)光分析要好 2022/4/14 五、生物發(fā)光分析法 ? 在生物發(fā)光分析中 ， 通常涉及到酶促反應(yīng)和發(fā)光反應(yīng) ? 這類發(fā)光分析不僅靈敏度高 ， 選擇性也好 2022/4/14 ? 例如： ? ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP● LH2● E + Mgppi + 2H+ pH 7~8 ATP： 三磷酸腺苷； LH2： 熒光素； E： 熒光素酶； AMP： 磷酸腺苷； ppi： 無機(jī)焦磷酸 ? AMP● LH2● E + O2 [氧化熒光素 ]* + AMP +CO2 + H2O ? [ 氧 化 熒 光 素 ]* 氧 化 熒 光 素 + hν （ λmax=562nm） 2022/4/14 ? 方法可用于 10μL試樣中 1014g的 ATP測定 ， 線性范圍達(dá) 6個(gè)數(shù)量級 ? 此外 ， 生物化學(xué)發(fā)光法在免疫反應(yīng)和酶的固定化技術(shù)中也有不少應(yīng)用 。 該法為生化分析提供了一條新途徑 。 可使生化分析趨于微量 、 特異 、 靈敏和快速 2022/4/14 六、化學(xué)發(fā)光分析法的應(yīng)用 ? 化學(xué)發(fā)光分析最大的特點(diǎn)是靈敏度高，對氣體和痕量金屬離子的檢出限都可達(dá) ngcm－ 3級 ? 在環(huán)境檢測中化學(xué)發(fā)光法比吸收光譜法和微庫侖法具有更高的靈敏度，又能進(jìn)行快速連續(xù)分析，因此氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)已廣泛用于空氣中有害物質(zhì)如 O 氮氧化物、 CO、 SO H2S等的監(jiān)測。其測