實(shí)驗(yàn)二gstz基因的pcr擴(kuò)增-資料下載頁
2025-02-21 23:35本頁面
【正文】 ed (cannot be extended by the polymerase) Has two fluorescent dyes attached: 1. Reporter (R) 2. Quencher (Q) ? 339。 539。 Fluorogenic 539。 nuclease assay (TaqMan? chemistry) R Q forward primer reverse primer 339。 339。 539。 539。 339。 539。 539。 1. Polymerisation probe Q 339。 339。 539。 539。 339。 539。 539。 2. Strand displacement Q 339。 339。 539。 539。 339。 539。 539。 3. Cleavage R 339。 539。 539。 339。 539。 539。 4. Polymerisation pleted Q R R = Reporter Q = Quencher 339。 ? 隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加， TaqMan探針釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系 ? TaqMan探針應(yīng)用基因檢測、病毒定量、細(xì)胞因子基因定量、癌細(xì)胞基因微突變檢測等 ? 其結(jié)果都具有高特異性與高敏感性 ? 但只適合于一個(gè)特定的目標(biāo) SYBR Green I ?結(jié)合到雙鏈 DNA的小溝部位 ?只有和雙鏈 DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 SYBR Green I 工作原理 未結(jié)合的 SYBR green I 結(jié)合解離曲線識(shí)別不同的 PCR產(chǎn)物 95 ℃ 15sec。 60℃ 20sec。 95 ℃ 15sec 在 60 ℃ ～ 95 ℃ 之間的 Ramp time設(shè)為 19:59 SYBR Green I的特點(diǎn) ? 可以用于不同的模板 ? 使用方便，價(jià)格相對(duì)便宜 ? 靈敏度很高 ? 與非特異性產(chǎn)物結(jié)合 ?解離曲線 ?選擇良好的引物和探針并優(yōu)化反應(yīng)條件 定量 —— 絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法 ? 標(biāo)準(zhǔn)品：純化的質(zhì)粒 dsDNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA ? 準(zhǔn)確配制標(biāo)準(zhǔn)系列并且注意其穩(wěn)定性，最好分裝后保存于 80℃ ? 假設(shè)目的基因與看家基因 擴(kuò)增效率相同 ，數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出 ? 目的基因的量 =2ΔΔCt ? ΔΔC t=(Ct目的基因 Ct管家基因 )實(shí)驗(yàn)組 (Ct目的基因 Ct管家基因 )對(duì)照 ? 2ΔΔ Ct表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù) ? 在目的基因與看家基因 擴(kuò)增效率相同 的情況下可以直接得到的目的基因相對(duì)于管家基因的定量，而不必制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 ? 更為簡便省時(shí)，也是相當(dāng)可靠的 定量 —— 相對(duì) Ct值方法 the expression of GPR30 in prostate cells0246810smcfbSMC++ BPH1 22RV1 LNCAP DU145PC3GPR30/betaactinExpression of GPR30 in different prostate cells 011 2 3Relative GeneExpression(GPR30/GAPDH)Effect of siRNA on the expression of GPR30 in 293T cells transfected with pGPR30IRES2EGFP plasmid 1. Control 2. anti GPR30 siRNA 3. Scramble siRNA
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