生物化學(xué)實驗報告-蛋白質(zhì)分子量測定--凝膠層析法等-資料下載頁
2025-01-18 22:45本頁面
【正文】 ml）=(((A0Am)/A0*100%)/50%)*反應(yīng)液總體積數(shù)*（樣液稀釋倍數(shù)/樣液體積）總活性（U）=單位活性測定*酶原液總體積 （4）蛋白質(zhì)含量測定（考馬斯亮藍(lán)G250法） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支試管，編號，按下表加試劑：試劑管 號123456蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ml）0蒸餾水（ml）0考馬斯亮藍(lán)G250(ml)555555蛋白質(zhì)含量（ug）020406080100 蓋上塞子，搖勻。注意各管振蕩程度盡量一致。在595nm波長下比色測定光密度，比色應(yīng)在1h內(nèi)完成。以牛血清蛋白含量（ug）為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品中蛋白含量的測定將待測的SOD溶液并稀釋到一定濃度，取1支具塞試管，，其余操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同。蛋白質(zhì)含量計算根據(jù)所測樣品提取液的光密度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，計算其濃度。 實驗結(jié)果：表 3時間(min)1234A圖 3 計算得：A0=。酶活力測定中三個不同量樣液的光密度值見下表：表 4時間(min)1234樣1(50μl)樣2(100μl)樣2(100μl)計算（方法同1）得： A1=；A2=；A3=。酶活性單位的計算：單位活性（U/ml）=表 5樣液體積(ml)酶原液總體積(ml)Am單位活性(U/ml)總活性(U)樣114樣2樣35（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試劑管 號123456蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ml）0蒸餾水（ml）0考馬斯亮藍(lán)G250(ml)555555蛋白質(zhì)含量（ug）020406080100光密度值（A595）0（2） 樣品蛋白質(zhì)含量樣品光密度測定值及蛋白質(zhì)含量的計算結(jié)果如下表：表 6樣號A595平均值蛋白質(zhì)含量(μg)蛋白質(zhì)濃度(μg/μl)樣1樣2樣3（3） 數(shù)據(jù)處理表 7提純步驟酶液總體積ml蛋白質(zhì)mg/ml酶活性U/ml總活性U比活性U/mg回收率%純化倍數(shù)除血蛋白上清141001熱變性后上清丙酮沉淀后(g) 實驗結(jié)果分析 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線不是一條直線，可能是由于分光光度計的讀數(shù)誤差，也有可能是認(rèn)人為誤差。解決方法，可以多次測量取平均值，再舍去離標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)的點，使標(biāo)準(zhǔn)曲線兩邊的點數(shù)目盡量一樣多，再繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣就可以減少偶然誤差。 樣品一的蛋白質(zhì)含量過高，從后面的電泳圖也可以看出樣品1混有雜質(zhì)，說明分離SOD同工酶時細(xì)胞可能有溶血。里面含有雜質(zhì)，所以吸光值較大在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量就過高，所以樣品1的蛋白質(zhì)含量不準(zhǔn)確。 ,可能會對后續(xù)實驗結(jié)果造成影響，最大的影響就是使得所測樣品中SOD同工酶抑制鄰苯三酚的自氧化率會減小，從而計算出來的酶活性相應(yīng)減小。 本實驗純化過程中，蛋白質(zhì)含量、酶總活性逐漸降低，比活性逐漸增加。而酶活性本應(yīng)隨著酶純度的增加而增大，但本實驗沒有這樣的現(xiàn)象。SOD純化倍數(shù)逐漸增加，最后達(dá)到約10倍，但是回收率卻只有21%，偏低。說明本實驗還存在很多問題，在操作時需要注意。20
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