生物化學實驗報告-蛋白質(zhì)分子量測定--凝膠層析法等(參考版)
2025-01-21 22:45本頁面
【正文】 20。SOD純化倍數(shù)逐漸增加，最后達到約10倍，但是回收率卻只有21%，偏低。 本實驗純化過程中，蛋白質(zhì)含量、酶總活性逐漸降低，比活性逐漸增加。里面含有雜質(zhì)，所以吸光值較大在標準曲線上所對應的蛋白質(zhì)含量就過高，所以樣品1的蛋白質(zhì)含量不準確。解決方法，可以多次測量取平均值，再舍去離標準曲線較遠的點，使標準曲線兩邊的點數(shù)目盡量一樣多，再繪制標準曲線，這樣就可以減少偶然誤差。酶活力測定中三個不同量樣液的光密度值見下表：表 4時間(min)1234樣1(50μl)樣2(100μl)樣2(100μl)計算（方法同1）得： A1=；A2=；A3=。蛋白質(zhì)含量計算根據(jù)所測樣品提取液的光密度，在標準曲線上查得相應的蛋白質(zhì)含量，計算其濃度。以牛血清蛋白含量（ug）為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪出標準曲線。注意各管振蕩程度盡量一致。（2） 酶活力測定操作與（1）基本一致，加入鄰苯三酚前，蒸餾水則減少相應的體積，同理測其光密度值，計算加酶后鄰苯三酚自氧化率。C水浴保溫20min，取出后立即加入25176。將沉淀物用等體積的丙酮溶液洗二次，離心收集沉淀，自然干燥既得淡綠色成品，按1mg/ml溶于蒸餾水，備用。C恒溫水浴中進行熱處理，15min后取出迅速冷卻至室溫，4000r/m，5min，除沉淀，得淺黃色粗酶液，留樣2ml。%，均勻呈暗紅色，再繼續(xù)攪拌15min，4000r/m，10min，去變性蛋白沉淀物，得上層液，留樣2ml。三、 操作步驟 SOD的提?。?） 取新鮮豬血20ml（:1的比例加入ACD抗凝劑），4000r/m，10min，去上層血漿，取下層紅血球粘稠液，并量其體積，%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min，棄上清液，得洗凈的紅血球濃稠液。用“負”顯色法，核黃素經(jīng)光照所產(chǎn)生的活性氧O2（氧自由基）能使氯化硝基四氮唑藍（NBT）由黃色的氧化型轉(zhuǎn)化為藍色的還原型。在一定的范圍內(nèi)，溶液在595nm波長下光密度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定，在測定范圍11000ug。樣品中蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍G250法測定。酶活力測定可以用一下方法：鄰苯三酚自氧化法、黃嘌呤氧化酶法、NBT光還原法、化學發(fā)光法、腎上腺素自氧化法、亞硝酸法等。SOD將O2歧化為H2O2，而過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化酶可催化過氧化氫分解，在機體內(nèi)形成一套解毒系統(tǒng)，對機體起防護作用。在某些疾病過程中會產(chǎn)生大量的O2。在一些正常生理過程中會形成一些O2。機體內(nèi)O2的過量和不足均對機體不利，SOD對過量的O2的及時清除保證了機體內(nèi)O2的含量的相對平衡。CuZnSOD為二聚體，呈藍綠色；MnSOD呈紫色；FeSOD呈黃褐色。SOD是一種酸性蛋白，對熱、PH和蛋白酶的水解較一般酶穩(wěn)定。實驗三 豬血中超氧化物歧化酶（SOD）的分離純化及活力測定 一、實驗目的通過本次實驗熟悉掌握超氧化物歧化酶（SOD）的分離純化方以及SOD活力的測定。（5）脫色將染色液倒回瓶內(nèi)，加入漂洗液洗，漂洗兩次，每次12小時，照相保存。待溴酚藍走出分離膠后30分鐘停止電泳，取出玻璃板，剝膠染色。表1 凝膠的制備試劑配方聚丙烯酰胺凝膠組成分離膠（10%）濃縮膠（3%）30%AcrBis（ml）H2O(含SDS、TEMED)（ml） TrisHCL(含SDS、TEMED)（ml）10%AP（ul）0100075（3）加樣及電泳 待凝膠聚合完全后，拔掉電泳梳子，然后將電泳槽注滿電泳緩沖液，取適量上清液加樣，在標準泳道點是上高分子標準蛋白質(zhì)溶液。在組裝好的電泳槽中先制分離膠，待分離膠聚合后，倒掉乙醇溶液，再灌濃縮膠，灌好濃縮膠后迅速插入樣
規(guī)章制度相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1