生物化學(xué)第7章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征-資料下載頁(yè)
2025-01-18 02:01本頁(yè)面
【正文】 是在惰性的基質(zhì)上結(jié)合有離子交換基團(tuán) 。 常用的基質(zhì)有纖維素 、 交聯(lián)葡聚糖 、 瓊脂糖 、 交聯(lián)瓊脂糖等；離子交換基團(tuán)有陽(yáng)離子和陰離子兩種類(lèi)型 ， 其中又分為強(qiáng)陽(yáng)性（ 酸性 ） 離子交換基團(tuán)和弱陽(yáng)性 （ 酸性 ） 離子交換基團(tuán) ， 及強(qiáng)陰性 （ 堿性 ） 離子交換基團(tuán)和弱陰性（ 堿性 ） 離子交換基團(tuán) 。 陽(yáng)離子交換介質(zhì) 陰離子交換介質(zhì) 離子交換層析 Ⅱ 蛋白質(zhì)分子上具有各種陰陽(yáng)離子基團(tuán) ， 在一定的 pH下 ， 蛋白質(zhì)分子帶有凈正電荷或凈負(fù)電荷 ，它們可與離子交換劑上的相應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行離子交換 ，使蛋白質(zhì)分子通過(guò)靜電引力吸附到離子交換劑上 。改變 pH和 （ 或 ） 離子強(qiáng)度又可將這些吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái) 。 離子交換層析 Ⅲ 在一定的上樣和洗脫條件下 ， 因不同的蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷和電荷密度不同 ， 分子大小也不同 ， 它們與離子交換劑的結(jié)合力不同 ， 結(jié)合力較弱的先洗脫下來(lái) ， 結(jié)合力較強(qiáng)的后洗脫下來(lái) ， 從而達(dá)到分離的目的 。 洗脫可分單一溶液洗脫 、 階段洗脫和梯度洗脫 ， 既可以改變洗脫液的離子強(qiáng)度 ， 也可以改變 pH， 也可以兩者同時(shí)改變 。 離子交換結(jié)合洗脫原理 梯度混合器 K=VM / VR 層析聚焦 用特種多緩沖液 （ polybuffer）淋洗層析柱中的特種多緩沖交換劑（ polybuffer exchanger），就會(huì)在柱中產(chǎn)生一個(gè)由上而下的 pH梯度。隨著 pH梯度 向下移動(dòng)，達(dá)到等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)將順序被洗脫下來(lái)。 利用選擇性吸附的純化方法 1． 羥基磷灰石層析：羥基磷灰石即結(jié)晶磷酸鈣（ Ca10(PO4)6(OH)2） ， 它能吸附蛋白質(zhì) ， 加大離子強(qiáng)度可將蛋白質(zhì)洗脫下來(lái) 。 2． 疏水作用層析：疏水層析介質(zhì)有丁基瓊脂糖 、苯基瓊脂糖 、 辛基瓊脂糖等 ， 蛋白質(zhì)分子通過(guò)疏水作用與層析介質(zhì)結(jié)合 ， 通過(guò)能減弱疏水作用的洗脫液將不同蛋白質(zhì)分別洗脫下來(lái) 。 利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法 將能與目的蛋白特異結(jié)合的配體偶聯(lián)到基質(zhì)上 ，在適當(dāng)?shù)臈l件下 ， 將蛋白質(zhì)混合物上樣 ， 目的蛋白結(jié)合在柱中 ， 而雜蛋白直接流出 。 經(jīng)洗柱 (washing)后 ， 換用能減弱目的蛋白與配體結(jié)合力的洗脫液 ，將目的蛋白洗脫 (eluting)。 （親和層析） 親和層析原理 高效液相層析和快速蛋白質(zhì)液相層析 分離純化的原理與柱層析相同 ， 只是用全自動(dòng)的儀器操作 ， 它們有更高的效率 、 更高的分辨率和更快的過(guò)柱速度 。 自動(dòng)部分收集器 六、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 Ⅰ 1． 雙縮脲法 雙縮脲試劑：稱取 CuSO4 5H2O和 6g酒石酸鉀鈉溶于 500ml水中 ， 在不斷攪拌下 ， 加入 300ml 10% NaOH， 稀釋至 1000ml。 3ml蛋白質(zhì)溶液加 2ml雙縮脲試劑 ， 540nm比色 。 2． 紫外吸收法 280nm比色 ， 測(cè)定后蛋白質(zhì)溶液還能回收 。 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 Ⅱ 3． Folin酚法 （ Lowry法 ） 蛋白質(zhì)中的酪氨酸或半胱氨酸 ， 能與 Folin酚試劑起氧化還原反應(yīng) ， 生成藍(lán)色化合物 ， 500nm比色測(cè)定 。 Folin酚試劑的配制比較復(fù)雜 。 4． BCA法 蛋白質(zhì)還原 Cu2 +成 Cu+， 與 4,4’二羧基 2,2’二喹啉 （ BCA） 形成配合物 ， 顯紫色 ， 比色測(cè)定 。 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 Ⅲ 5． 染料結(jié)合法 蛋白質(zhì)能結(jié)合考馬斯亮蘭 G250， 顯藍(lán)色 ，595nm比色 。 染色液的配制：考馬斯亮蘭 G250 100mg， 加50ml 95%乙醇 （ 或甲醇 ） 和 100ml 85%磷酸 ， 加水至 1000ml。 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 Ⅳ 6． 膠體金測(cè)定法 膠體金是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體 ， 根據(jù)顆粒大小的不同呈現(xiàn)不同的顏色 （ 從小到大 ， 從桔紅色到紫紅色 ） 。 膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核 （ 原子金Au） 及包圍在外的雙離子層構(gòu)成 ， 緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子 （ AuC12－ ） ， 外層離子層 H+則分散在膠體間溶液中 。 蛋白質(zhì)分子可結(jié)合在膠體金顆粒的外層 ， 使膠體金的顏色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色 。 蛋白質(zhì)純度鑒定 各種層析單峰 ， 電泳單帶 ， 雙向電泳單點(diǎn) ，末端氨基酸測(cè)定一種 ， 溶解度曲線單轉(zhuǎn)折點(diǎn) 。
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