生物化學(xué)簡明教程第二章蛋白質(zhì)-資料下載頁
2025-01-16 13:54本頁面
【正文】 鏈內(nèi)的二硫鍵 ④ 分析每一條多肽鏈的氨基酸組成 ⑤ 鑒定多肽鏈的 N末端和 C末端殘基 ⑥ 把多肽鏈裂解成兩組以上大小不等的較小片段 ⑦ 測定各肽段的氨基酸序列 ⑧ 重疊各肽段，重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)順序 ⑨ 確定半胱氨酸殘基間形成的二硫鍵的位置 ① .多肽鏈數(shù)目的測定 根據(jù)蛋白質(zhì) N端和 C端殘基的摩爾數(shù)和蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量可確定分子中的多肽鏈數(shù)目。若含一條多肽鏈，蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)與末端基的摩爾數(shù)相等；如果后者是前者的倍數(shù)，說明該蛋白質(zhì)分子是由多條多肽鏈組成。如果檢測到的末端基多于一種，表明蛋白質(zhì)由兩條或多條不同的多肽鏈組成，即樣品是雜多聚蛋白質(zhì)（ heteromultimeric protein）。 ② .拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈 寡聚蛋白質(zhì)的亞基必須拆分?？捎米冃詣┤?8 mol/L尿素、 6 mol/L鹽酸胍或高濃度鹽處理。若亞基間通過二硫橋（ SS） 交聯(lián)，如胰島素（含兩條多肽鏈）和 α胰凝乳蛋白酶（含 3條多肽鏈）則可用氧化劑或還原劑將二硫鍵斷開。 拆開后的單個(gè)多肽鏈可根據(jù)它們的大小或 /和電荷的不同進(jìn)行分離、純化。 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用 8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈 (亞基 ). ③ .拆開多肽鏈內(nèi)的二硫橋 多肽鏈內(nèi)半胱氨酸殘基之間的 SS橋必須在進(jìn)行第 4步前予以斷裂。 幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或 6mol/L鹽酸胍存在下， 用過量的 ?巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。 可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵 。 ④ .測定每一條多肽鏈的氨基酸組成 分離純化的多肽鏈一部分樣品完全水解，測定氨基酸組成 ， 計(jì)算氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。 ⑤ .鑒定多肽鏈的 N端和 C端殘基 多肽鏈的另一部分樣品進(jìn)行末端殘基的鑒定，以便建立兩個(gè)重要的氨基酸序列參考點(diǎn)。 *N端測定 Ⅰ .二硝基氟苯（ DNFB或 FDNB， sanger試劑 ） 法 DNFB與 AA的 α NH2的反應(yīng)被廣泛用于測定 N末端AA。 多肽或蛋白質(zhì)的游離末端 NH2與 DNFB反應(yīng)生成DNP多肽或 DNP蛋白質(zhì)對(duì)酸水解比肽鍵穩(wěn)定，因此DNP多肽經(jīng)酸水解后，只有 N末端 AA為黃色 DNPAA衍生物，其余的都是游離 AA。 鑒別 DNPAA， 便可得知多肽鏈的 N末端殘基。 多肽側(cè)鏈上的 εNH 酚 OH等也與 DNFB反應(yīng)，但生成的側(cè)鏈 DNP衍生物，如 εDNP賴氨酸當(dāng)用有機(jī)溶劑（如乙酸乙酯）抽提時(shí)將與游離氨基酸一起留在水相，因而容易和 αDNP氨基酸區(qū)分開來。待分析的 DNP氨基酸可用紙層析、薄層層析或 HPLC進(jìn)行分離鑒定和定量測定。 Ⅱ .丹磺酰氯（ dansylchloride， DNS） 法 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡稱，原理與 DNFB法相同。丹磺?；袕?qiáng)烈的熒光，靈敏度比 DNFB法高 100倍，且水解后的 DNSAA不需提取，可直接用紙電泳或薄層層析加以鑒定。 Ⅲ .苯異硫氰酸酯（ PITC， Edman試劑 ） 法 多肽和蛋白質(zhì)的末端氨基和 AA的 α NH2能與 PITC作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白質(zhì)，稱 PTC多肽或蛋白質(zhì)，它在酸性有機(jī)溶劑中加熱時(shí)， N末端的 PTCAA環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脲的衍生物并從肽鏈上脫下，除去 N端 AA的肽鏈仍然完整。代表 N端殘基的 PTHAA經(jīng)有機(jī)溶劑抽提干燥后，可用薄層層析（如硅膠薄膜或聚酰胺薄膜）、氣相色譜和HPLC鑒定。 Ⅳ .氨肽酶（ amino peptidase） 法 氨肽酶是一類肽鏈外切酶（ exopeptedase） 或稱為外肽酶，從多肽鏈的 N端逐個(gè)向內(nèi)切，根據(jù)反應(yīng)時(shí)間的不同測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，作出反應(yīng)時(shí)間與殘基釋放的動(dòng)力學(xué)曲線，來推測蛋白質(zhì)的 N端氨基酸序列。但困難在于酶對(duì)各種肽鍵的敏感程度不一樣，常常難于判斷哪個(gè)殘基在前，哪個(gè)殘基在后。 亮氨酸氨肽酶（ leucine amino peptidase, shorted by LAP）對(duì)以亮氨酸的氨基形成的肽鍵的水解速度最快，對(duì)其它肽鍵的水解速度則較慢。 當(dāng)谷氨酸環(huán)化而形成焦谷氨酸氨使 N端被封閉時(shí)，使用焦谷氨酸氨肽酶（ pyroglutamate aminopeptidase） 則可專一性地水解焦谷氨酸氨 NH2形成的肽鍵。 *C端測定 Ⅰ .肼解（ hydrazinolysis） 法 C端測定的重要方法。蛋白質(zhì)或多肽與無水的肼加熱時(shí)發(fā)生肼解， C端 AA以游離形式存在，其它氨基酸都形成相應(yīng)的氨基酰肼化物，它與苯甲醛作用形成不溶于水的二苯基衍生物，游離的 C端 AA以 FDNB和 DNS鑒定。谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸被破壞不易測定， C端的精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸。 Ⅱ .還原法 肽鏈 C末端 AA可用硼氫化鋰還原為 α氨基醇，肽鏈完全水解后，代表原來 C端 AA的 α氨基醇可用層析加以鑒別。 Ⅲ .羧肽酶（ carboxypeptidase） 法 有效和常用。專一性從 C端逐個(gè)水解出游離 AA，被釋放的 AA數(shù)目與種類隨反應(yīng)時(shí)間而變化，由此推測C端氨基酸序列。幾個(gè)氨基酸釋放速度相近或兩個(gè)相同氨基酸毗鄰時(shí)，小心結(jié)果。 ⑥ .裂解多肽鏈成較小的片段 用兩種或幾種不同的斷裂方法（指斷裂點(diǎn)不一樣）將每條多肽鏈樣品降解成兩套或幾套重疊的肽段或稱肽碎片。每套肽段進(jìn)行分離、純化，并對(duì)每一純化了的肽段進(jìn)行氨基酸組成和末端殘基的分析。 A. 酶解法 :胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 B. 化學(xué)法 ：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵 。 C H 3 S ：C H 2C H 2C HN H C N H C H CO OR+ B r C+NB rC H 3 S+C H 2C H 2C HN H C N H C H CO ORC NC H 3 S C N C H2C HN H C N H C H CO ORC H 2+H 2 O+C H 2C HN H COC H 2O H 3 N+C H COR高絲氨酸內(nèi)酯 ⑦ .測定各肽斷的氨基酸序列 最常用 Edman降解法，并有自動(dòng)序列分析儀可供利用，此外尚有酶解法和質(zhì)譜法等。 ⑧ .建立完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu) 利用兩套或多套肽段的氨基酸序列彼此間有交錯(cuò)重疊可以拼湊出原來的完整多肽鏈的氨基酸序列。 ⑨ .確定半胱氨酸殘基間形成的 SS交聯(lián)橋的位置 氨基酸序列測定中不包括輔基成分分析，但是它應(yīng)屬于蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)容。 一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過甲酸處理后，將每個(gè)肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。
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