【正文】 Biochemistry 127 肌紅蛋白 (Mb)和血紅蛋白 (Hb)的氧結(jié)合曲線 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 128 一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 ? 純化的實(shí)質(zhì) 增加制品（ preparation）的純度或比活力 ? 蛋白質(zhì)分離純化的一般程序： 前處理、抽提 粗分級(jí) 細(xì)分離 濃縮結(jié)晶 保存 第四節(jié) 蛋白質(zhì)分離純化與鑒定 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 129 電泳 前處理 粗分離 細(xì)分離 生物組織 無細(xì)胞提取液 破碎 、 溶 解 、 差速離心 選擇性沉淀法 親和 層析 離子交換層析 精制后的蛋白質(zhì) 凝膠 過濾 疏水 層析 吸附層析 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 130 （ 1）前處理： ? ①將組織和細(xì)胞破碎 ? 動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)（ waring blender) 勻漿器（ homogenizer) 超聲波處理（ ultrasonication) ? 植物組織和細(xì)胞：石英砂 +提取液，研磨 纖維素酶處理 ? 細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、 溶菌酶處（分解肽聚糖） ? ②差速離心法收集細(xì)胞的某一組分 ? ③如果提取膜蛋白： ? 超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 131 （ 2）蛋白質(zhì)的抽提。 ? 通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_溶液把蛋白質(zhì)提取出來。 （ 3）粗分級(jí) ? 一般用選擇性沉淀法。 ? ①（ NH4） 2SO4分級(jí)沉淀法（鹽析） ? ②等電點(diǎn)選擇性沉淀法 ? ③有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法 ? ④熱處理選擇性沉淀法 ? ⑤生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 132 （ 4）細(xì)分離 ? ①透析除鹽 ? ② sephdex G25凝膠過濾除鹽 ? 層析法：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相 HPLC） ? 電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤狀電泳、等電聚焦、雙向電泳 ? 密度梯度離心 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 133 （ 5）濃縮晶體與保存 ? 濃縮方法：真空冷凍干燥法，蛋白質(zhì)幾乎無變性。 ? 保存方法： ? ①晶體保存： ? 結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度 的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。 ? 結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié) pH、接入晶種。 ? ②凍干粉保存： ? ③溶液保存： ? 加入抗凍劑（ 50%甘油）后 20～ 70℃ 保存。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 134 二、混合蛋白質(zhì)分離純化的方法 ? （一）根據(jù)分子大小分離 ? （二）根據(jù)電荷差異分離 ? （三）根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度分離 ? （ 四 ） 根據(jù)配體特性異性分離 （ 親和層析 ） ? 選擇性吸附分離 （ 物理吸附 ） ? 根據(jù)疏水性的差異 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 135 （一）根據(jù)分子大小和形狀的差異 ? 凝膠過濾法 ? 凝膠過濾層析 利用一定大小孔隙的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠作層析介質(zhì)（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等），根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小、形狀不同擴(kuò)散到凝膠孔隙內(nèi)的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。也稱 分子排阻層析、分子篩 。 ? 優(yōu)點(diǎn)：操作方便，所需設(shè)備簡(jiǎn)單。 ? 缺點(diǎn)：分辨率低，分離操作較慢。 ? 交聯(lián)葡聚糖（ Sephadex）、 ? 聚丙烯酰胺凝膠（ BioGel P ）、 ? 瓊脂糖凝膠（ Sepharose， BioGel A） 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 136 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 137 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 138 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 139 半透膜 阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。 透析和超濾法：除去小分子物質(zhì) 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 140 超濾： 施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過一半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子。 優(yōu)點(diǎn)：常溫、條件溫和、節(jié)能環(huán)保，適合濃縮富集。 缺點(diǎn)：不能直接得到干粉制劑。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 141 ? 離心法 ? 借助于離心力，由于比重不同的物質(zhì)所受到的離心力不同，從而沉降速度不同。 ? 使樣品中不同質(zhì)量、密度、大小和形狀的顆粒達(dá)到分離。 ? 濃度梯度離心、差速沉降離心 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 142 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 143 （ 二 ） 根據(jù)電荷性質(zhì)的差異 : 電泳 ? 電泳：液體介質(zhì)中帶電的膠體微粒在外電場(chǎng)作用下相對(duì)液體的遷移現(xiàn)象 。 ? 根據(jù)大分子或顆粒的電荷 、 大小和形狀不同 ， 使其在通過電場(chǎng)中的凝膠或介質(zhì)時(shí)發(fā)生分離的方法 。 ? 普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細(xì)管電泳 ? 從電泳結(jié)果分：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、盤狀電泳 ? 從裝置上分：圓盤電泳 （ 柱狀 ） 、 水平板電泳 、 垂直板電泳 。 ? 從支持物分：自由界面電泳 、 紙電泳 （ 或薄膜電泳 ） 、 凝膠電泳 （ PAGE ， 瓊脂糖膠 ， 淀粉膠等 ） 離子交換層析法 （ 同氨基酸 ） 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 144 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 145 （三）根據(jù)溶解度差異的分離： ① 選擇性沉淀法 鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法 重金屬鹽選擇性沉淀法 （ pH＞ pI， 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷 ） 生物堿和酸選擇性沉淀法 （ pH＜ pI， 蛋白質(zhì)帶正電荷 ） 熱處理沉淀法 （ 銅鋅 SOD， 65℃ 、 15分鐘 、 穩(wěn)定 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 146 ② 等電點(diǎn)沉淀 ? 在等電點(diǎn)條件下 ， 蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性 、 溶解度最小 ， 粘度最大 。 ? 在 pI時(shí) ， 分子電荷為零 ， 蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥消失 ， 從而蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集沉淀 。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 147 ③ 蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析 ? 鹽溶： 低鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度 ↑ ，稱鹽溶。 ? 在蛋白質(zhì)水溶液中，加入少量的中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等，會(huì)增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與水分子的作用，從而使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大。 ? 鹽析： 高鹽濃度時(shí) ， 使 pr溶解度 ↓ 析出 ， 稱鹽析 。 ? 鹽析多用溶解度大的中性鹽 ， 如 (NH4)2SO NaCl、MgCl NH4Cl、 KCl等的飽和溶液 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 148 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 149 （ 四 ） 以蛋白質(zhì)的特異性相互作用為依據(jù) ? 配體親和力的差異 ： 親和層析 ? 酶的底物 、 輔酶 、 抑制劑 、 效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物 ，激素與受體蛋白 ， 抗原與抗體 ， 生物素與親和素 （ 抗親和素蛋白 ） ， 凝集素 。 ? 免疫親和層析 ? 凝集素親和層析 ? 金屬螯和層析 ? 染料配體層析 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 150 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 151 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 152 三、蛋白質(zhì)含量測(cè)定及純度鑒定 ? （一）測(cè)定蛋白質(zhì)總量 ? 凱氏定氮 法 ? 樣品與硫酸加熱，將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮，換算為蛋白質(zhì)含量。 ? 靈敏度低，干擾少，費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)，現(xiàn)不多用。 ? 雙縮脲法（ Biuret法） ? 多肽鍵＋堿性 Cu2＋ 生成紫色絡(luò)合物 ，于 540nm下比色，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 ? 常用于快速測(cè)定，但不太靈敏。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 153 ? Folin－酚試劑法（ Lowry法） ? 此法與雙縮脲法原理相同，由于加了第二種試劑 Folin－酚試劑，增加了顯色量，提高了測(cè)定蛋白質(zhì)的靈敏度。 ? 其他方法 ? 如考馬斯亮藍(lán)法 (Bradford法 ) ，靈敏度最高能檢測(cè) 1181。g 的蛋白質(zhì)，快速 5～ 15分鐘 ，考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其 lmax由 465nm變?yōu)?595nm 強(qiáng)堿性緩沖液。 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 154 ? （二）測(cè)定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量 ? （三）鑒定蛋白質(zhì)制品的純度 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 155 ? 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 ? 蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。 ? 自從 1953年 級(jí)結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有 2500種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。 第五節(jié)蛋白質(zhì)的測(cè)序（選讀） 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 156 ? 測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求 ? 1）氨基酸組成分析 ? （ 1）樣品必需純（ 97%以上）； ? （ 2）知道蛋白質(zhì)的分子量； ? （ 3）知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)多肽鏈組成； ? （ 4）測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。 ? 2）末端氨基酸分析 ? （ 1） N末端分析 ? （ 2） C末端分析 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 157 ? 蛋白質(zhì)的測(cè)序的步驟 ? （一）肽鏈分離 ? （二）肽鏈降解 ? （三）肽段分離 ? （四）順序分析 ? （五）二硫鍵定位 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 158 ? 第一章作業(yè) ? P52：第 7題 ? 補(bǔ)充 熟悉 21種基本氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和性質(zhì)。 ? 補(bǔ)充 概念名詞解釋： ? 等電點(diǎn)、電泳、亞基、蛋白質(zhì)變性、 ? 別構(gòu)效應(yīng) ? （播放蛋白質(zhì)動(dòng)畫） 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 159 Goodbye . 2022/2/13 ZhangJGBiochemistry 160