保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法-資料下載頁
2025-01-15 00:58本頁面
【正文】 1mol/－，即完全培養(yǎng)液。 ConA液 用雙蒸水配制成100ug/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱(－20℃)保存。 無菌Hanks液 ％－。 MTT液 將5mgMTT溶于1mL ，現(xiàn)配現(xiàn)用。 酸性異丙醇溶液 96mL 異丙醇中加入4mL 1mo1/L的HC1，臨用前配制。 脾細胞懸液制備 無菌取脾，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hanks液洗3次，每次離心10min (1000r/min)。然后將細胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)(應(yīng)在95％以上)，調(diào)整細胞濃度為2106個/mL。 將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，一孔加50ul ConA液(相當(dāng)5ug/mL)，另一孔作為對照，置5％CO2，37℃培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，同時加入MTT(5mg/mL)50u1/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝3～6孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570nm波長測定光密度值。也可將溶解液直接移入1mL比色杯中，在721分光光度計上比色測定，波長570nm。 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定 一般采用方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力，受試物組的光密度值顯著高于對照組的光密度值，即可判定該項試驗結(jié)果陽性。 同位素摻入法 原理 淋巴細胞在有絲分裂原PHA、ConA等的刺激下，產(chǎn)生增殖反應(yīng)，DNA和RNA合成明顯增加，如在培養(yǎng)液中加入3H－胸腺嘧啶核苷(3H－TdR)，則可被轉(zhuǎn)化中的細胞攝入。測定標(biāo)記淋巴細胞和放射強度可反映淋巴細胞增殖的程度。 儀器和材料 RPMI－1640細胞培養(yǎng)液、小牛血清、2－巰基乙醇(2－ME)、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A (ConA)、Hanks液 、PBS緩沖液(－)、3H－TdR、閃爍液[－二苯基 惡唑(PPO) 、1，4－雙－(5－苯基 惡唑基)－苯(POPOP)、二甲苯500mL混勻] 200目篩網(wǎng)，96孔培養(yǎng)板(平底)，手術(shù)器械、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、液體閃爍儀、多頭細胞取集器、49型玻璃纖維濾紙。 實驗步驟 脾細胞懸液制備 無菌取脾，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hanks液洗3次，每次離心10min(1000r/min)。然后將細胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)(應(yīng)在95％以上)，最后RPMI1640完全培養(yǎng)液將細胞數(shù)調(diào)成5105個/mL。 淋巴細胞增殖反應(yīng)： 將脾細胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，200ul/孔，每一份脾細胞懸液分裝6個孔，3孔加ConA(5ug/mL)，另3個孔不加ConA作為對照。置5％ CO2，37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h，每孔加入3H－TdR 20u1，使其終濃度為(－)104Bq/mL。用多頭細胞取集器將細胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測量瓶中，加入7mL閃爍液，用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)(cpm). 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定 一般采用方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。以每分鐘脈沖數(shù)(cpm)表示增殖程度，用刺激指數(shù)(SI)來表示 試驗孔cpm 17
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