層析技術(shù)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-14 15:24本頁(yè)面
【正文】 裝柱 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 洗脫液的選擇 ?凝膠層析的分離機(jī)理簡(jiǎn)單以及凝膠穩(wěn)定工作的pH范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。 ?為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 加樣量 ?快速、均勻 ?加樣過多，會(huì)造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實(shí)驗(yàn)效率低。 ?一般分級(jí)分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的1％ 5％左右 ?分組分離時(shí)加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的 10％ 25％。 ?樣品的粘度不能過大，否則會(huì)影響分離效果。 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 洗脫速度 ?保持洗脫速度恒定通常有兩種方法 ?使用恒流泵 ?恒壓重力洗脫 ?洗脫速度取決于很多因素，包括柱長(zhǎng)、凝膠種類、顆粒大小等 ?洗脫速度慢樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會(huì)造成樣品擴(kuò)散加劇、區(qū)帶變寬，反而會(huì)降低分辨率，而且實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)大大延長(zhǎng) 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 凝膠層析的應(yīng)用 ?（ 一）生物大分子的純化 分級(jí)分離抗原或抗體 ?（ 二）分子量測(cè)定 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 Ve log Mr 對(duì)同一類型的化合物 ,洗脫特性與組分的分子量有關(guān) ,流過凝膠柱時(shí) ,按分子量(MW)大小順序流出 ,MW大的走在前面 ,Ve與 MW的關(guān)系可用下式表示 : Ve = K1 K2lgMW K1,K2 為常數(shù) , MW為分子量 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 （三）脫鹽及去除小分子雜質(zhì) ? 利用凝膠層析進(jìn)行脫鹽及去除小分子雜質(zhì)是一種簡(jiǎn)便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脫鹽要快得多，而且一般不會(huì)造成樣品較大的稀釋，生物分子不易變性。 ?一般常用的是 Sephadex G25等排阻極限較小的凝膠類型。 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 Elution volume (ml) Albumin NaCl ? Desalting in a simple column 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)： 凝膠層析法分離蛋白質(zhì) 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 血紅蛋白 64,480 二硝基苯 魚精蛋白 2,00012,000 Sephadex G50 孔徑 1,50030,000 一、原理： Kd=0 Kd=1 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 裝柱 ※ 先用蒸餾水趕走層析柱中的死體積； ※ 凝膠不能有氣泡和分層現(xiàn)象； ※ 裝柱結(jié)束后要保持凝膠表面平整。 二、操作注意點(diǎn)： 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 ■ 凝膠柱 的 裝填 方法： 裝 填 膠 體 暫 停 流 洗 X 繼 續(xù) 流 洗 已 堆 積 沉 淀 中 上 清 緊 密 堆 積 檢 查 好 管 柱 是 否 暢 通 1 2 Gel Gel 繼 續(xù) 流 洗 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 加樣 ※ 使液面和凝膠表面相切，關(guān)閉出口； ※ 加樣時(shí)盡量不要破壞凝膠面； ※ 讓樣品進(jìn)入凝膠以后在加蒸餾水開始洗脫。 2022年 3月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 血紅蛋白和二硝基苯 魚精蛋白的洗脫體積？ 三、結(jié)果要求：
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