親和層析ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-14 06:07本頁(yè)面
【正文】 11 ? 由于受體蛋白在激素與其互補(bǔ)的膜結(jié)合中的重要作用，同時(shí)其含量極低，使研究受阻。利用親和層析法分離受體蛋白成為可能。 ? 例：胰島素受體蛋白的純化：將胰島素偶聯(lián)到溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，結(jié)合受體蛋白，特異性洗脫，釋放出目標(biāo)蛋白質(zhì)。 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss48 2022/2/11 ? ? 用基因工程的方法引入 特殊結(jié)合位點(diǎn) （如金屬結(jié)合位點(diǎn)），將其加在重組目的蛋白的 氨基端或羧基端 。 ? 緊鄰結(jié)合位點(diǎn)的位置加入蛋白酶切割位點(diǎn) ，以便在用親和層析純化之后，將多余的蛋白質(zhì)片段去掉 。 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss49 2022/2/11 金屬螯合層析 ? 基于蛋白質(zhì)的 組氨酸咪唑基 和 半胱氨酸巰基 能與 銅 、 鋅 、 鎳離子 間形成穩(wěn)定的 螯合物 而進(jìn)行分離的。 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss50 2022/2/11 ? 很多的酶中都含有不同類(lèi)型的輔酶，最為常見(jiàn)的是氧化還原酶和脫氫酶含有 NAD。為此用固定化的 NAD可以分離不同類(lèi)型的氧還酶和脫氫酶，或激酶。 ↓ ↓ ↓ 固定化NAD柱 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss51 2022/2/11 ? 染料樹(shù)脂 ? 不專(zhuān)一的親和介質(zhì) ? 優(yōu)點(diǎn) : ? 穩(wěn)定、和許多類(lèi)型的酶結(jié)合，但又不被酶所作用、價(jià)格低廉。 ? ? eg. Cibacron藍(lán) F3GA。 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss52 2022/2/11 ?堿性磷酸單酯酶的分離 小牛小腸粘膜抽提液用 DEAE離子交換纖維素除去部分雜蛋白 酶活性的級(jí)分再上平衡的活性染料艷藍(lán) KGRS和交聯(lián)瓊脂糖 4B偶聯(lián)的染料層析柱 平衡液洗除雜蛋白 含有 再吸附在活性染料 Procion紅 HE33與交聯(lián)葡聚糖凝膠G100偶聯(lián)的基質(zhì)柱上 用含有 ，酶活性出現(xiàn)在 5m mol/L磷酸鹽濃度時(shí) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 回收率 62％ 回收率 96％ 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss53 2022/2/11 原理： 利用酶的活性中心具有結(jié)合配體的功能，可直接檢驗(yàn)酶的活力；失活的酶雖然在其它方法中仍然可檢測(cè)到蛋白質(zhì)的存在，但對(duì)于其活性不能判斷，圖A，無(wú)活性則不能與親和吸附劑結(jié)合時(shí)，從親和柱中穿流而出；活性部分因結(jié)合，通過(guò)洗脫得到分離，圖 B。 A280 具有結(jié)合能力及催化活性 親和層析 A280 穿流峰 洗脫峰 圖 A 圖 B 二、研究酶的結(jié)構(gòu)與功能 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss54 2022/2/11 思考題 1. 在親和層析時(shí)，為什么床休積比較小？為什么無(wú)親和力的物質(zhì)只能產(chǎn)生一個(gè)層析峰？ 2. 簡(jiǎn)述親和層析的分辨率比一般吸附層析高的原因。 3. 配體應(yīng)具備哪些條件？ 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 wss55 2022/2/11 ，親和層析與吸附層析、離子交換層析、凝膠層析有哪些異同點(diǎn)？ A、 B、 C、 D四種蛋白質(zhì)組分的混合液中，A和 B均為含有葡萄糖鏈的糖蛋白，其 pI分別為 ，而 C和 D分子量分別是 40000和 50000，試設(shè)計(jì)用層析法分離它們的方案。
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