凝膠過濾層析ppt課件-資料下載頁
2025-01-14 08:56本頁面
【正文】 再取少量起始緩沖液洗滌柱壁 ? 加樣時應盡量 減少凝膠床面的攪動 。 加樣的方法可以是直接將樣品加到層析床表面，或可用微量泵控制 洗脫和收集 ? 打開起始緩沖液閥門，連續(xù)洗脫。 ? 用自動部分收集器自動或手動收集，合并同一高峰各管 。 ? 洗脫時應注意的問題 ： ? 流速不宜過快且要穩(wěn)定 ? 洗脫液的成分也不應改變 （凝膠溶脹程度） ? 整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓 ? 可以用水或緩沖液作洗脫液 流速對洗脫曲線的影響 流速較低，分辨率較高 常用恒流泵控制 凝膠的再生及保存 ? 再生 ? 用過的凝膠經 NaOH和 HCl溶液分別處理后可以恢復其性能，或參照凝膠產品說明書 ? 凝膠的保存方法 ? %疊氮鈉或 %雙氯苯雙胍己烷 應用：測定相對分子質量 ? 標準曲線法 ? 對于 特定的測定系統(tǒng) ，先以 3個以上（越多越好）的已知分子量的標準蛋白（目前已有配套標準蛋白系列產品出售）過柱，測取各自的 Ve值。以 Ve作縱坐標， LogM作橫坐標制做標準曲線。 ? 在 同一測定系統(tǒng) 中測出未知物質的 Ve值便可由標準曲線求得分子量。分子量在 10 000～ 150 000之間的球形蛋白用此法測出的分子量誤差在 10％左右 Ve log M 標準曲線 凝膠過濾層析的特點 ? 優(yōu)點： ? 操作條件溫和，樣品回收率可接近 100％，并且重復性高。 ? 作為脫鹽手段，與透析法相比速度快、精度高；與超濾法相比，蛋白活性收率高； ? 分離機理簡單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大 ? 缺點： ? 分辨率不高，對于分子量相差不多的物質難以達到很好的分離 ? 料液處理量小，并且樣品粘度不宜太高 ? 分離操作較慢，由于凝膠層析是以物質分子量的不同作為分離依據(jù)的，分子量的差異僅表現(xiàn)在流速的差異上，流速過快會降低分辨率
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