【正文】 癌物的符合率＞ 85%）和費(fèi)用省等優(yōu)點(diǎn)。 ? 選擇誘變劑的種類(lèi) ：在選用理化因子作誘變劑時(shí)，在同樣效果下，應(yīng)選用 最方便 的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇 最高效 的因素。在物理誘變劑中，尤以 紫外線 為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如 NTG(N甲基N’硝基 N亞硝基胍 )。 ? 采用簡(jiǎn)便有效的誘變方法： 紫外線的照射最為方便。 化學(xué)誘變劑的種類(lèi)、濃度和處理方法尤其是中止反應(yīng)的方法很多，實(shí)際工作時(shí)可參看有關(guān)書(shū)籍。一種較有效的簡(jiǎn)易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長(zhǎng)出許多單菌落，最后可用影印培養(yǎng)法或逐個(gè)檢出法選出突變種。 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（ synergism） ? 誘變劑的復(fù)合處理常常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，這對(duì)育種工作是很有參考價(jià)值的。復(fù)合處理有幾類(lèi)： ①兩種或多種誘變劑的先后使用； ②同一種誘變劑的重復(fù)使用； ③兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。 挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（ original strain） ? 選用出發(fā)菌株的一般原則 ： ①最好是經(jīng)過(guò)生產(chǎn)中選育過(guò)的自發(fā)變異菌株； ②采用具有優(yōu)良性狀的菌株，如生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株 ③選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株； ④細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)稱(chēng)為增變菌株的變異菌株，更適宜作出發(fā)菌株； ⑤在選擇產(chǎn)核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時(shí)，最好考慮至少能累積少量所需產(chǎn)物或其前體的菌株，而在選擇產(chǎn)抗生素的出發(fā)菌株時(shí)，最好選擇已通過(guò)幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價(jià)都有一定程度提高的菌株作為出發(fā)菌株。 處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液 ? 對(duì)單細(xì)胞微生物必須處理單細(xì)胞、均勻懸液的原因 ? 分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻接觸誘變劑，避免長(zhǎng)出不純菌落。 ? 處理霉菌或放線菌孢子 的原因： ? 絲狀微生物的細(xì)胞內(nèi)同時(shí)含有幾個(gè)核，故某一突變無(wú)法反映在當(dāng)代的表型上。只有當(dāng)經(jīng)過(guò) DNA的復(fù)制發(fā)生細(xì)胞分裂后，這一變異才會(huì)在表型上表達(dá)出來(lái)，于是出現(xiàn)了不純菌落，這就叫表型延遲（ phenotypic lag） （或由于誘變劑一般只作用于 DNA雙鏈中的某一條單鏈，也會(huì)出現(xiàn)表型延遲）。這也是誘變育種工作中初分離的菌株經(jīng)傳代后很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀“衰退”的主要原因。 ? 細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)誘變的效果會(huì)發(fā)生很大的影響 。 ? 獲得均勻分散的細(xì)胞懸液的方法 ：用無(wú)菌的玻璃珠打碎成團(tuán)的細(xì)胞，然后再用脫脂棉過(guò)濾。誘變后出現(xiàn)的不純菌落，則可用適當(dāng)?shù)姆蛛x純化方法加以純化。 利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo) ?為了確切某一突變株產(chǎn)量性狀的提高程度，必須進(jìn)行大量的分析測(cè)定和統(tǒng)計(jì)工作，而一些形態(tài)變異雖能直接和迅速地加以觀察，但又不一定與產(chǎn)量變異相關(guān)。如果能找到這兩者間的相關(guān)性，則育種時(shí)初篩的效率就可大大提高。如在灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉的育種中，發(fā)現(xiàn)菌落的棕紅顏色變深者，產(chǎn)量往往有所提高； ?形態(tài)、生理與代謝產(chǎn)物產(chǎn)量間的相關(guān)性常常可通過(guò)人們的努力而加以創(chuàng)造。利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其它方法就可有效地把原來(lái)肉眼所觀察不到的生理性狀或產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)的“形態(tài)”性狀。例如，在瓊脂平板上，通過(guò)蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈的大小，抗生素抑制圈的大小，生長(zhǎng)因子周?chē)尘L(zhǎng)圈的大小，以及外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，都可用于初篩工作中估計(jì)某菌產(chǎn)生相應(yīng)代謝產(chǎn)物能力的“形態(tài)”指標(biāo)。 選用最適劑量 ? 誘變劑劑量 一般指強(qiáng)度與作用時(shí)間的乘積。各種誘變劑有不同的劑量表示方式，如化學(xué)誘變劑以一定溫度下誘變劑的濃度和處理時(shí)間來(lái)表示。在育種實(shí)踐中，常以殺菌率來(lái)作誘變劑的相對(duì)劑量。 ? 誘變劑的合適劑量 ：凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，能擴(kuò)大變異幅度，促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。 ? 要確定一個(gè)合適的劑量，常常要經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn) 。就一般微生物而言，在一定的劑量范圍內(nèi)，突變率往往隨劑量的增高而提高，但正變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中；還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，更容易出現(xiàn)負(fù)變。因此，在誘變育種工作中，目前大家比較傾向于采用較低的劑量。 篩選方案 ? 在實(shí)際工作中，一般認(rèn)為應(yīng)采用把篩選工程分為初篩與復(fù)篩兩個(gè)階段的篩選方案為好。前者以量（選留菌株的數(shù)量）為主，后者以質(zhì)（測(cè)定數(shù)據(jù)的精確度）為主。例如，在工作量限度為 200只搖瓶的具體條件下，為了取得更大的工效，有人提出了一些優(yōu)選的篩選方案（可參考有關(guān)專(zhuān)著） 篩選方法 ?一般通過(guò)初篩與復(fù)篩對(duì)突變株進(jìn)行生產(chǎn)性能的測(cè)定。 ?初篩既可在培養(yǎng)皿平板上進(jìn)行，也可在搖瓶中進(jìn)行，兩者各有利弊。 ?復(fù)篩是對(duì)突變株的生產(chǎn)性能作比較精確的定量測(cè)定。一般是將微生物搖瓶培養(yǎng)，然后再對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行分析測(cè)定。 ?不僅需要設(shè)計(jì)效率更高的篩選方法，還應(yīng)努力推廣篩選操作的自動(dòng)化。 .營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類(lèi)培養(yǎng)基 ? 基本培養(yǎng)基 （ MM， minimal medium）：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)需要的最低成分組合培養(yǎng)基，稱(chēng)基本培養(yǎng)基?？捎梅?hào)“ [－ ]”來(lái)表示。 ? 完全培養(yǎng)基 （ CM， plete medium）：凡可滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的組合培養(yǎng)基，可稱(chēng)為完全培養(yǎng)基?？捎梅?hào)“ [＋ ]”。 ? 補(bǔ)充培養(yǎng)基 （ SM， supplemental medium）：凡只能滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)需要的組合培養(yǎng)基，稱(chēng)為補(bǔ)充培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基的符號(hào)可根據(jù)加入的是 A或 B等代謝物而分別用 [A]或 [B]等來(lái)表示。 與營(yíng)養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類(lèi)遺傳型個(gè)體 ? 野生型 ：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株。 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 ：野生型菌株經(jīng)誘變處理后，喪失了某酶的合成能力，只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，這類(lèi)突變稱(chēng)為營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株（簡(jiǎn)稱(chēng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型）。 ? 原養(yǎng)型 ：營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變經(jīng)回變或重組后產(chǎn)生的菌株，營(yíng)養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選方法 ? 誘變劑處理 ? 淘汰野生型（抗生素法、菌絲過(guò)濾法） ? 檢出缺陷型（夾層培養(yǎng)法、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法、逐個(gè)檢出法、影印接種法） ? 鑒定缺陷型（生長(zhǎng)譜法） 第七節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯和保藏 ?衰退與復(fù)壯的概念 衰退（ degeneration） ： 在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中，由于變異的存在，使原有的優(yōu)良性狀發(fā)生負(fù)變，即菌種的衰退。 復(fù)壯 (rejuvenation)： 狹義的復(fù)壯 是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種分離和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施； 廣義的復(fù)壯 是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測(cè)定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種 防止菌種衰退的方法 ?控制傳代的次數(shù) （一般在 DNA的復(fù)制過(guò)程中，堿基的錯(cuò)配率是 5x104，自發(fā)突變的頻率為 108~109，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的次數(shù) ） ?創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 ?利用不同類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代： 對(duì)絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種。 ?采用有效的菌種保藏方法 菌種的復(fù)壯措施 ?純種分離 菌落純的分離方法 （平板表面涂布法，平板劃線分離法，瓊脂培養(yǎng)基澆注法） 細(xì)胞純的分離方法 （分離小室進(jìn)行單細(xì)胞分離，顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離，菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離） ?通過(guò)宿主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)壯 （如 Bacillus thuringiensis的復(fù)壯） ?淘汰已衰退的個(gè)體 （采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體） 二、菌種的保藏 ?菌種保藏機(jī)構(gòu)的任務(wù) ： 廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株（包括病毒株以及動(dòng)、植物細(xì)胞株和質(zhì)粒等）的基礎(chǔ)上，使之達(dá)到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。 ?常用的菌種保藏機(jī)構(gòu) ： 中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì) (CCCCM) 美國(guó)的典型菌種保藏中心 (ATCC) 菌種保藏的原理 ?挑選典型菌種的優(yōu)良純種 一般采用微生物的休眠體（如孢子、芽孢等） ?創(chuàng)造適于微生物長(zhǎng)時(shí)期休眠的環(huán)境條件（如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸堿中和劑等） 菌種保藏的方法 菌 連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）移種 種 生活態(tài) 傳代培養(yǎng)保藏法 連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種 保 固體斜面 藏 濕法 半固體瓊脂柱 方 休眠態(tài) 液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液） 法 干法 藏在玻璃管內(nèi) 吸附在合適的載體上 干法保藏菌種的方法 滴入小試管（在放入大試管干燥器中） 藏在玻璃管內(nèi) 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法（ L干燥 法 ） 冷凍真空干燥法 細(xì)粒狀載體（土壤、沙粒、土壤 +沙粒） 球塊狀載體（硅膠、瓷球） 合適的載體 有機(jī)基質(zhì)（曲料、麥粒） 濾紙片 薄片狀載體 明膠小片 （滴在蠟紙板上干燥而成） 血清蛋白小片（ … 乙烯薄膜 … ） 幾種常用菌種保藏方法的比較 方法名稱(chēng) 主要措施 適宜菌種 保藏期 評(píng)價(jià) 冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固體） 石蠟油封藏法 * 沙土保藏法 冷凍干燥法 低溫 低溫 低溫、缺氧 干燥、無(wú)營(yíng)養(yǎng) 干燥、無(wú)氧、低溫、有保護(hù)劑 各大類(lèi) 細(xì)菌、酵母菌 各大類(lèi) ** 產(chǎn)孢子微生物 各大類(lèi) 3~6月 6~12月 1~2年 1~10年 5~15年以上 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便有效 簡(jiǎn)便、有效 二 、 遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式 ? （一）核酸存在的七個(gè)水平及質(zhì)粒 ? 細(xì)胞水平： 存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體 ? 細(xì)胞核水平： 單核或多核結(jié)構(gòu) ? 染色體水平： 倍性 (真核 )和染色體數(shù) ? 核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或 RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈 ? 基因水平：一切具有自主復(fù)制能力的遺傳 功能單位均可稱(chēng)為基因。 1000bp大小， 分子量約 105Dalton ? 密碼子水平： 第三位模糊 ,起始和終止 ,信息單位 ? 核苷酸水平： 突變或交換單位 ? （ colicinogenic factor） ? 產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是一種由 某些菌株所分泌的細(xì)菌素，具有通過(guò)抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專(zhuān)一地殺死其它腸道細(xì)菌的功能。大腸桿菌素都是由質(zhì)粒 ——Col因子編碼的。 ? Col因子可分為兩類(lèi)，分別以 ColE1和 Col I b為代表。前者分子量小，約為 5 106Dalton，無(wú)接合作用，是多 copy的；后者的分子量約為 80 106Dalton，它與 F因子相似，具有通過(guò)接合作用轉(zhuǎn)移的功能，屬于嚴(yán)緊型控制，只有 1~2個(gè) copy。 凡帶 Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對(duì)大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。 ? ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組 DNA 的研究和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上。 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) (abortive transduction) ? 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) ：經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得了供體菌 DNA片斷的受體菌，如果外源 DNA在其內(nèi)僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達(dá)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（ gene