【正文】 第八章 微生物的遺傳變異與育種 ?第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) ?第二節(jié) 微生物的基因組結(jié)構(gòu) ?第三節(jié) 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子 ?第四節(jié) 基因突變及修復(fù) ?第五節(jié) 基因重組 ?第六節(jié) 微生物育種 ? 第七節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏 遺傳與變異的概念 遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一。 ? 遺傳 ：親代將自身一整套遺傳因子傳遞給下一代的行為和功能， ? 變異 ：生物體的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變，在群體中以極低的幾率（ 105~106）出現(xiàn)，性狀變化幅度大；新性狀穩(wěn)定、可遺傳。 ? 遺傳型 （ genotype）：一個(gè)生物體所含有的基因的總和。 ? 表型 （ phenotype）：一個(gè)生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和。 ? 飾變 （ modification）：指生物體由于非遺傳因素引起的表型改變，變化發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平，特點(diǎn)是幾乎整個(gè)群體中的每一個(gè)個(gè)體都發(fā)生同樣的變化，性狀變化的幅度小，不遺傳，引起飾變的因素消失后，表型即可恢復(fù)。舉例： Serratia marcescens 的紅色素在 25℃ 和 37℃的變化。 研究微生物遺傳的意義 ?微生物的獨(dú)特生物學(xué)特性： （ 1） 個(gè)體的體制極其簡單； （ 2） 營養(yǎng)體一般都是單倍體； （ 3） 易于在成分簡單的組合培養(yǎng)基上大量生長繁殖； （ 4） 繁殖速度快； （ 5） 易于積累不同的中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物； （ 6） 菌落形態(tài)特征的可見性和多樣性； （ 7） 環(huán)境條件對(duì)微生物群體中各個(gè)個(gè)體作用的直接性和均一性； （ 8） 易于形成營養(yǎng)缺陷型； （ 9） 各種微生物一般都有相應(yīng)的病毒； （ 10） 存在多種處于進(jìn)化過程中的原始有性生殖方式； ?微生物是研究現(xiàn)代遺傳學(xué)和其它許多主要的 生物學(xué)基本理論問題 中最熱衷的 研究對(duì)象 。 ?對(duì)微生物遺傳規(guī)律的深入研究，不僅促進(jìn)了 現(xiàn)代 分子生物學(xué) 和 生物工程學(xué) 的發(fā)展，而且為 育種 工作 提供了豐富的理論基礎(chǔ)，促使育種工作從不自覺到自覺、從低效到高效、從隨機(jī)到定向、從近緣雜交到遠(yuǎn)緣雜交的方向發(fā)展。 研究微生物遺傳學(xué)的意義 第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) ?種質(zhì)連續(xù)理論 ： 1883~1889年間 Weissmann提出。認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物。 ?基因?qū)W說 ： 二十世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)了染色體并提出基因?qū)W說，使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上 。 染色體由核酸和蛋白質(zhì)兩種長鏈高分子組成。 20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合，可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達(dá)到一個(gè)天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡單得多，一般僅由 4種不同的核苷酸組成，它們通過排列組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸，因此當(dāng)時(shí)認(rèn)為決定生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是 蛋白質(zhì) 。 ?DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明 ： 1944年以后，利用微生物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行的三個(gè)著名實(shí)驗(yàn)（肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、噬菌體感染試驗(yàn)、病毒的拆開與重建試驗(yàn)） 1928年， Griffith進(jìn)行了以下幾組實(shí)驗(yàn)： （ 1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 對(duì)小鼠注射活 R菌或死 S菌 ————小鼠存活 對(duì)小鼠注射活 S菌 ————————小鼠死亡 對(duì)小鼠注射活 R菌和熱死 S菌 ———小鼠死亡 抽取心血分離活的 S菌 一、三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn) ?（一） 經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) （ transformation）： ， ?研究對(duì)象： Streptococcus pneumoniae（肺炎雙球菌） ?S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有莢膜 ?R型菌株：無致病性，菌落表面粗糙，無莢膜 （ 2）細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 熱死 S菌 ————— 不生長 活 R 菌 ————— 長出 R菌 熱死 S菌 +活 R 菌 ————— 長出大量 R菌和 106S菌 （ 3） S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗(yàn) 活 R菌 +S菌無細(xì)胞抽提液 ————長出大量 R菌和少量S菌 以上實(shí)驗(yàn)說明：加熱殺死的 S型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進(jìn)入 R型細(xì)胞并使 R型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀 ?① 加 S菌 DNA ?② 加 S菌 DNA及 DNA酶以 外的酶 ?③加 S菌的 DNA和 DNA酶 ?④加 S菌的 RNA ?⑤ 加 S菌的蛋白質(zhì) ?⑥加 S菌的莢膜多糖 活 R菌 長出 S菌 只有 R菌 1944年 、 M。 McCarty從熱死 S型 S. pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分 ， 在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)： 只有 S型細(xì)菌的 DNA才能將 S. Pneumoniae的 R型轉(zhuǎn)化為 S型 。 且 DNA純度越高 ， 轉(zhuǎn)化效率也越高 。 說明 S型菌株轉(zhuǎn)移給 R型菌株的 ， 是遺傳因子 。 （二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn) ? A. D. Hershey和 M. Chase， 1952年 （ 1） 含 32PDNA的一組：放射性 85%在沉淀中 （ 2） 含 35S蛋白質(zhì) 的一組：放射性 75%在上清液中 所以 ， 進(jìn)入細(xì)胞的是噬菌體的核酸而不是蛋白質(zhì) 。 （三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) ?為了證明核酸是遺傳物質(zhì)， H. FraenkelConrat（ 1956）用含 RNA的煙草花葉病毒（ TMV）進(jìn)行了著名的 植物病毒重建實(shí)驗(yàn) 。 ?將 TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質(zhì)外殼與 RNA核心相分離。分離后的 RNA在沒有蛋白質(zhì)包裹的情況下，也能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子 。 ?選用 TMV和 霍氏車前花葉病毒（ HRV） ，分別拆分取得各自的 RNA和蛋白質(zhì)，將兩種 RNA分別與對(duì)方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒： （ 1） RNA（ TMV） 蛋白質(zhì)（ HRV） （ 2） RNA（ HRV） 蛋白質(zhì)（ TMV） ?用兩種雜合病毒感染寄主： （ 1）表現(xiàn) TMV的典型癥狀病分離到正常 TMV粒子 （ 2）表現(xiàn) HRV的典型癥狀病分離到正常 HRV粒子。 ?上述結(jié)果說明，在 RNA病毒中， 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸。 元病毒的發(fā)現(xiàn)和思考 ?元病毒含有微量的核酸，仍未發(fā)現(xiàn)？ ?元病毒僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成 ?元病毒的遺傳物質(zhì)為蛋白質(zhì)？ 第二節(jié) 微生物的基因組結(jié)構(gòu) ? 基因組：細(xì)胞中基因以及非基因的 DNA序列的總稱，包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控序列以及目前功能未知的 DNA序列。 ? 微生物的基因組一般較小，見 P137 原核生物（大腸桿菌）的基因組 ? 緊密纏繞的環(huán)狀雙鏈 DNA分子 ? 遺傳信息的連續(xù)性 ? 功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu) ? 結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及 rRNA基因的多拷貝 ? 基因組的重復(fù)序列少而短 真核生物（啤酒酵母）的基因組 ? DNA與組蛋白構(gòu)成染色體 ? 有間隔子或內(nèi)含子序列 ? 沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu) ? 含有一定數(shù)量的重復(fù)序列（低度、中度和高度重復(fù)） 遺傳豐余 ：較高同源性的 DNA重復(fù)序列 古細(xì)菌（詹氏甲烷球菌）的基因組 ? 古細(xì)菌的基因組結(jié)構(gòu)類似于細(xì)菌，即在環(huán)形 DNA分子上功能相關(guān)的基因組成操縱子結(jié)構(gòu)，無內(nèi)含子序列。 ? 負(fù)責(zé)信息傳遞功能的結(jié)構(gòu)（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯）類似于真核生物，如啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)、復(fù)制起始因子、 RNA聚合酶、翻譯延伸因子等 第三節(jié) 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子 原核生物的質(zhì)粒 ?定義 ： 是一類小型共價(jià)閉合環(huán)狀核外 DNA，能獨(dú)立于細(xì)胞核進(jìn)行自主復(fù)制?？梢酝ㄟ^交換摻入細(xì)胞核成為附加體；可以從寄主細(xì)胞中消除。 近年來也發(fā)現(xiàn)了線性雙鏈 DNA質(zhì)粒和 RNA質(zhì)粒 ?大小 ： 2~100 106Da，含有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)基因。 ?性質(zhì) ：質(zhì)粒是一種復(fù)制子，分為嚴(yán)緊型和松弛型，嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受細(xì)胞核控制，一般一個(gè)寄主細(xì)胞內(nèi)有 2~3個(gè)；松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受細(xì)胞核控制，在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量可以達(dá)到 1015個(gè) ?功能 ：進(jìn)行細(xì)胞間接合并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、降解功能等。 ?重組 ：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間菌可發(fā)生。 原核生物的質(zhì)粒 ?存在范圍 ：很多細(xì)菌如 、 Shigella、 、Streptococcus lactis Agrobacterium tumefaciens et al ?制備 ：包括增殖、裂解細(xì)胞、分離質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分、去除 RNA和蛋白質(zhì)等步驟。 ?鑒定 ：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法 幾種代表性質(zhì)粒： ?（ fertility factor） ? 致育因子 /性因子， 62 106Dalton， ，相當(dāng)于核染色體 DNA2%的環(huán)狀雙鏈 DNA，足以編碼94個(gè)中等大小多肽，其中 1/3基因（ tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。 ? 存在于腸細(xì)菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細(xì)菌中，決定性別。 ?（ mega質(zhì)粒） ? 為近年來在 Rhizobium（ 根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒，分子量為 200~300 106Dalton，比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質(zhì)粒，其上有一系列固氮基因。 ?（毒性）質(zhì)粒（ tumoe inducing plasmid） ? 即誘癌質(zhì)粒。長 200kb，是一種大型質(zhì)粒。 ? 存在于根癌土壤桿菌（ Agrobacterium tumefaciens）中。賦予宿主引起許多雙子葉植物的根癌的特性。 ? 當(dāng)帶有 Ti質(zhì)粒的細(xì)菌侵入植物細(xì)胞中后，在其細(xì)胞中溶解，把細(xì)菌的 DNA釋放至植物細(xì)胞中。含有復(fù)制子的 Ti質(zhì)粒的小片段與植物細(xì)胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞。 ? Ti質(zhì)粒已成為植物遺傳工程研究中的重要載體。一些具有重要形狀的外源基因可借 DNA重組技術(shù)設(shè)法插入到 Ti質(zhì)粒中，并進(jìn)一步使之整合到植物染色體上，以改變該植物的遺傳性，達(dá)到培育植物優(yōu)良品種的目的。 ? （ colicinogenic factor） ? 產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是一種由 些菌株所分泌的細(xì)菌蛋白，具有通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專一地殺死不含 Col因子的近緣的其它腸道細(xì)菌。 ? 凡帶 Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對(duì)大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。 ? 有些 G+細(xì)菌也產(chǎn)生細(xì)菌素，如用于食品保藏的 Nisin ? ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組 DNA 的研究和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上。 ?（抗生素抗性和重金屬抗性）因子（ resistence factor） ? 最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（ Shigella dysenteriae），后來發(fā)現(xiàn)還存在于 Salmonella、 Vibrio、 Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。 ? R因子由相連的兩個(gè) DNA片段組成，即抗性轉(zhuǎn)移因子（ resistence transfor factor， RTF ）和抗性決定因子（ rdeterminant）， RTF控制質(zhì)粒 copy數(shù)及復(fù)制，抗性決定因子帶有抗生素或重金屬的抗性基因。 ? R因子在細(xì)胞內(nèi)的 copy數(shù)可從 1~2個(gè)到幾十個(gè)，分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)?？蛇_(dá) 2022~3000個(gè) /細(xì)胞。 ?（代謝）質(zhì)粒 ? 如假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質(zhì)粒可為一系列能降解復(fù)雜物質(zhì)的酶編碼，從而能利用一般細(xì)菌所難以分解的物質(zhì)做碳源。這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名，例如有分解 CAM（樟腦）質(zhì)粒， XYL（二甲苯）質(zhì)粒， SAL（水楊酸）質(zhì)粒， MDL（扁桃酸）質(zhì)粒， NAP（奈）質(zhì)粒和 TOL（甲苯）質(zhì)粒等。 ? 不顯示任何表型效應(yīng)，只能通過物理的方法檢測的質(zhì)粒。如酵母菌的 2um質(zhì)粒。 ? 40年代 B. McClintock對(duì)玉米的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位，打破了基因是固定在染色體 DNA上的一些不可移動(dòng)的核苷酸片段的說法。有些DNA片段不但可在染色體上移動(dòng)，而且還可從一個(gè)染色體跳到另一個(gè)染色體，從一個(gè)質(zhì)粒跳到另一個(gè)質(zhì)粒或染色體，甚至還可從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。在這些 DNA順序的跳躍過程中，往往導(dǎo)致 DNA鏈的斷裂或重接，從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動(dòng)或關(guān)閉，結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生。這似乎就是自然界所固有的“基因工程”。目前已把在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段 DNA順序稱為 轉(zhuǎn)座因子 （ transposible element），也稱作 跳躍基因 （ jumping gene）或 可移動(dòng)基因 （ movable gene）。 轉(zhuǎn)座因子 插入（ IS）序列 轉(zhuǎn)座子 (Tn) 特殊病毒（ Mu噬菌體） 定義： 可在 DNA鏈上改變自身位置的一段 DNA序列。