酶組織化學(xué)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-05 20:14本頁(yè)面
【正文】 四唑鹽法 用于顯示氧化酶和脫氫酶 原理 : 四唑鹽或雙四唑鹽 氫離子 與 與 底物混合液 無(wú)色四唑鹽結(jié)合 紅色或蘭色的沉淀 脫氫酶 +2H 被還原 常用四唑鹽種類 三苯四唑氯化物 TTC 藍(lán)四唑鹽 BT 新四唑鹽 NT ? 硝基藍(lán)四唑 NBT ? 四硝基藍(lán)四唑 TNBT ? 噻唑藍(lán) MTT 以 琥珀酸（鈉鹽） 為底物，在酶的作用下脫氫，人工合成的 硝基藍(lán)四唑 （ NBT）為受 H體，其接受 H后被還原成紫色不溶物以代表琥珀酸脫氫酶的活性。 四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶 ※ 琥珀酸脫氫酶是線粒體的標(biāo)志酶之一。 SDH存在于所有有氧呼吸的細(xì)胞，以心肌、腎曲管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞含量最豐富△ 抑制物： 丙二酸鹽（競(jìng)爭(zhēng)抑制） —— 對(duì)照 【 孵育液 】 琥珀酸鈉 , 磷酸鹽緩沖液 NBT(硝基藍(lán)四唑 ) 【 步驟 】 1. 新鮮組織低溫冰凍切片 2. 孵育液 1535 分鐘 3. 生理鹽水洗 4. Fca(氯化鈣 Formalin)固定 10分鐘 5. 入 80%乙醇 5分鐘 6. 甘油明膠封固 【 結(jié)果 】 酶活性處為藍(lán)紫色沉淀 小鼠心肌冰凍切片 琥珀酸脫氫酶 X400 ? 思考題： 在細(xì)胞培養(yǎng)中，常用的 MTT法 測(cè)定細(xì)胞活性，用的是什么原理？檢測(cè)的是什么酶？ 顯示酶的組織化學(xué)方法 （二）聯(lián)苯胺色素法 ? 檢測(cè) 過(guò)氧化物酶 ? 酶作用釋放的 氧 使無(wú)色的聯(lián)苯胺 脫氫 而形成有色的 聯(lián)苯胺藍(lán) ，再形成聯(lián)苯胺褐。 ? 【 結(jié)果 】 酶活性處呈棕色 過(guò)氧化物酶 ? 催化各種物質(zhì)被過(guò)氧化氫（ H2O2）所氧化 ? 見于乳腺、甲狀腺、唾液腺、肥大細(xì)胞等 ? 髓過(guò)氧化物酶 見于中性和嗜酸性白細(xì)胞及其前體細(xì)胞中，對(duì)造血系統(tǒng)疾病的鑒別診斷極為重要 ? 免疫組化中常用 辣根過(guò)氧化物酶 （ HRP）作為大分子示蹤劑 ? 【 顯示方法 】 二氨基聯(lián)苯胺法 示過(guò)氧化物酶 ? 【 基本原理 】 過(guò)氧化物酶作用于底物（ 3，3二氨基聯(lián)苯胺， DAB），催化底物被 H2O2氧化，生成棕色的沉淀 ? 【 作用液 】 DAB， TrisHcl緩沖液， H2O2 ? 【 結(jié)果 】 酶活性處呈棕色 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 過(guò)氧化物酶 *400 白血病涂片 過(guò)氧化物酶 X400 顯示酶的組織化學(xué)方法 （三）靛酚藍(lán)法（吲哚酚法） ? 用于檢測(cè) 氧化酶 ，也可用于細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化物酶等。 ? 把 二甲基－對(duì)－苯二胺 和 α －萘酚 加入底物混合液中，由酶作用而釋放的 氧 與此二者發(fā)生結(jié)合，形成 靛酚藍(lán) ，而顯示出酶的定位。 如細(xì)胞色素氧化酶 顯示酶的組織化學(xué)的其他方法 ? 色素底物法 —— 是將有的色素鹽類作為酶的底物，它本身不染組織細(xì)胞，但在酶的作用下分解出來(lái)的色素卻能沉著于酶所在部位。 ? 底物標(biāo)記法 —— 是指用同位素、色素、金屬標(biāo)記酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉著于酶所在部位，通過(guò)各種方法對(duì)此進(jìn)行檢測(cè)。 酶組織化學(xué)的應(yīng)用 1. 了解組織、細(xì)胞的代謝活動(dòng) 2. 細(xì)胞類型的判斷 3. 了解細(xì)胞定位 4. 用于腫瘤的研究 5. 用于免疫組化和雜交組化的顯示手段 要求掌握的酶 ? 堿性磷酸酶 ? 酸性磷酸酶 ? 葡萄糖－ 6－磷酸酶 ? 三磷酸腺苷酶 ? 乳酸脫氫酶 ? 琥珀酸脫氫酶 ? 過(guò)氧化物酶法
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