【正文】 一致，僅為相對定量 ?測定依據： 蛋白質測定一般利用蛋白質以下的結構或性質 元素組成測定： 含 N穩(wěn)定； 重復的肽鏈結構： 具有多個肽鍵； 酪氨酸和色氨酸與 Folin酚試劑反應 顯色 或 UV 吸收； 與色素結合的能力： 與染料以離子鍵或共價鍵連接； 沉淀后借濁度測定： 光度計測定； 光折射測定： 折射儀測定。 ?方法 ： －參考方法 ( 推薦 ) 6. UV 法 ７ .折光測定法 －參考標準方法 ( N pro) 消化 用濃硫酸將蛋白質消化為硫酸銨；（耗時） 蒸餾 用堿性溶液堿化消化液并蒸餾揮發(fā)； 吸收 用酸性溶液（硼酸）吸收氣態(tài)氨（使 [H+] ） 滴定 用已標定的無機酸滴 （使 [H+] 恢復）， 計算總氮量 定蛋白 （ 總氮量 非蛋白氮） =蛋白含量 納氏試劑：碘化汞和碘化鉀的堿性溶液與氨反應生成淡黃棕色膠態(tài)化合物，其色度與氨氮含量成正比。 ?原理： 三聚氰胺化學式： C3N6H6，分子量： 126 含氮量達 66%。 ?評價： ?優(yōu)點：準確度高，精密度高，靈敏度高，是公認的參考方法。 ?缺點：操作復雜，費時，不適合常規(guī)檢測，血清各蛋白含氮量會有所變化尤其是疾病時。 ?應用：標準蛋白的標定及校正其它常規(guī)方法 縮脲法 ?原 理： 蛋白質中的肽鍵 （ CONH） 在 堿性 溶液中能與 Cu2+作用而產 生 紫紅色絡合物 ，其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，而與 蛋白質的分子量及氨基酸成分無關。 條件：至少含兩個肽鍵（ CONH）基團才能和 Cu2+形成絡合物 ,氨基酸及二肽無反 應 ,三肽以上才能反應。 雙縮脲生成 加熱 ＋ NH3 2 2 H－ 1800 2 2 2 2 2 N 端 C 端 ?評價： ?優(yōu)點：簡便，準確，重復性好， 10g120g/L線性好，特異性與精密度好，批內 CV%＜ 2%，顯色穩(wěn)定。 ?缺點：靈敏度較差，對蛋白質含量低的體液標本不適合。 ?應用：常規(guī)推薦方法。手工或上機使用。 (Folin試劑法） ?原理： 蛋白質分子中的 酪氨酸殘基 和 色氨酸殘基 能夠和 酚試劑中的 磷鎢酸 磷鉬酸 反應生成藍色化合物， Lowry改良法： 在 酚試劑中加入 Cu2+， 提高了呈色的靈敏度，為 雙縮脲法的 100倍左右。吸收峰為 745750nm。 ?評價及應用： ?優(yōu)點：操作簡單，改良法靈敏度高（ 10μ g60μg） ，適合測定蛋白含量少的標本。 ?缺點：各種蛋白質 酪氨酸 和 色氨酸 比例不同，只適合測定單一蛋白質。受一些藥物干擾。 ?原理： ?評價及應用： 優(yōu)點：簡便不需特殊儀器。 缺點：濁度形成的干擾因素多（加試劑方法，反應溫度，蛋白絮狀沉淀等） 某些酸類（磺基水楊酸等）和血清蛋白質結合產生沉淀，測其濁度，與標準對比，可求蛋白含量。 在酸性環(huán)境下，帶正電的蛋白質（ NH3+)與染料的陰離子產生顏色反應，使染料的吸收峰改變，可既而用分光光度法比色測定。 ?原理： 常用染料： 氨基黑，考馬斯亮藍 等 ? 考馬斯亮藍 G250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質 色素結合物在 595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。 ? 蛋白質與考馬斯亮藍 G250結合在 2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下 1h內保持穩(wěn)定。該法是 1976年 Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比 Lowry法還高 4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為 0～ 1 000μg／ mL，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。 ?評價及應用： ? 優(yōu)點：操作簡便，重復性好，靈敏度高，且干擾因素少。 ? 缺點：特異性不高；不同蛋白質和染料的結合力不一致，標準物不易確定。 （ 1） 蛋白質分子中的 酪氨酸 和 色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白質溶液在 280nm處有一吸收峰 ?？捎糜跍y定蛋白質但需避免核酸干擾。 （ 1） LowryKalcker 公式 蛋白質濃度（ mg/ml） = A 280 A 260 （ 2） WarburgChristian 公式 蛋白質濃度（ mg/ml） = A 280 A 260 ?原理： ?評價及應用： ?優(yōu)點：敏感而簡便，可 保留蛋白生物活性 ，常用與較純的酶和免疫球蛋白。需 紫外分光光度計及石英比色皿。 ?缺點：各種蛋白質中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm測定易受游離色 aa和酪 aa以及尿酸和膽紅素的干擾；核酸在 206nm有最大吸收，在 280nm有較大吸收，導致準確性和特異性受影響。 ?措施：在 220225nm波長區(qū)域，用 10002022倍可消除干擾。 ? （ 2） 稀溶液中蛋白質濃度測定的經驗公式：蛋白質的肽鍵在 200— 250nm有強的紫外吸收。其光吸收強度在一定范圍與濃度成正比，其波長越短，光吸收越強。若選用 215nm可減少干擾及光散射，用 215nm和 225nm光吸收差值與單一波長測定相比，可減少非蛋白質成分引起的誤差，因此，對稀溶液中蛋白質濃度測定，可選用 215nm和225nm光吸收差法。 ? 常用下列經驗公式： 蛋白質濃度（ mg/mL） =（ A215A225） 溶解在溶液中的固體可增加溶液的光折射率，在固定波長和溫度下，光折射率和血清中蛋白質含量成正比。 ?原理： ?評價及應用： ?優(yōu)點：簡便、快速，易掌握，重復性較好，適合臨床急診，體檢篩查和胸腹水蛋白質測定。 ?缺點：準確性較差，易受高血脂癥，高膽紅素血癥以及溶血等因素影響，會由于 A/G比值變化而產生誤差。 ?參考范圍：成人 60－ 80g/L ?臨床意義： 總蛋白升高： 總蛋白降低：①丟失過多 ②消耗增加 ③白蛋白合成減少 ④水腫 真性升高： MM、巨球蛋白血癥、自身免疫性疾病等 假性升高：機體明顯失水，總蛋白含量相對升高， A/G幾乎不變 二、血清白蛋白測定 ?方法 ： ( 推薦 ) ( 推薦 ) ?原理 : 血清 ALB可通過 離子鍵或疏水鍵 與包括 染料 在內的各種有機離子結合 ,而 GLB很少結合外源性染料 ,可在 不分離 ALB與 GLB的情況下直接測定 ALB。 染料 BCG BCP 優(yōu)點 缺點 易于和非人源性白蛋白結合 與白蛋白結合特異性較差 與 非人源性白蛋白結合力弱 與白蛋白結合特異性好 在 30秒內測可提高特異性 ?應用及評價 : 嚴格控制反應時間的 BCG法 既適合 手工 也適合 自動 化分析。 臨床上推薦使用 。 ?原理 : 鹽析是由于加入大量的中性鹽破壞了蛋白質的 水化膜、 中和其所帶的 電荷 從而使蛋白質分子聚集而 沉淀 析出。 各種蛋白質的 親水性 和 帶電荷不同 ，故鹽析時所需 鹽濃度與 pH不同。GLB在生理 pH下帶電荷及水化膜比 ALB少 ，可被較低濃度中性鹽沉淀。 中性鹽： 硫酸銨、硫酸鈉等 ?應用及評價 : 操作繁瑣， 不宜自動化，基本不用