【正文】 一致，僅為相對(duì)定量 ?測(cè)定依據(jù)： 蛋白質(zhì)測(cè)定一般利用蛋白質(zhì)以下的結(jié)構(gòu)或性質(zhì) 元素組成測(cè)定： 含 N穩(wěn)定； 重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu)： 具有多個(gè)肽鍵； 酪氨酸和色氨酸與 Folin酚試劑反應(yīng) 顯色 或 UV 吸收； 與色素結(jié)合的能力： 與染料以離子鍵或共價(jià)鍵連接； 沉淀后借濁度測(cè)定： 光度計(jì)測(cè)定； 光折射測(cè)定： 折射儀測(cè)定。 ?方法 ： －參考方法 ( 推薦 ) 6. UV 法 ７ .折光測(cè)定法 －參考標(biāo)準(zhǔn)方法 ( N pro) 消化 用濃硫酸將蛋白質(zhì)消化為硫酸銨；（耗時(shí)） 蒸餾 用堿性溶液堿化消化液并蒸餾揮發(fā)； 吸收 用酸性溶液（硼酸）吸收氣態(tài)氨（使 [H+] ） 滴定 用已標(biāo)定的無機(jī)酸滴 （使 [H+] 恢復(fù)）， 計(jì)算總氮量 定蛋白 （ 總氮量 非蛋白氮） =蛋白含量 納氏試劑：碘化汞和碘化鉀的堿性溶液與氨反應(yīng)生成淡黃棕色膠態(tài)化合物，其色度與氨氮含量成正比。 ?原理： 三聚氰胺化學(xué)式： C3N6H6，分子量： 126 含氮量達(dá) 66%。 ?評(píng)價(jià)： ?優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確度高，精密度高，靈敏度高，是公認(rèn)的參考方法。 ?缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，不適合常規(guī)檢測(cè)，血清各蛋白含氮量會(huì)有所變化尤其是疾病時(shí)。 ?應(yīng)用：標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)定及校正其它常規(guī)方法 縮脲法 ?原 理： 蛋白質(zhì)中的肽鍵 （ CONH） 在 堿性 溶液中能與 Cu2+作用而產(chǎn) 生 紫紅色絡(luò)合物 ，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與 蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)。 條件：至少含兩個(gè)肽鍵（ CONH）基團(tuán)才能和 Cu2+形成絡(luò)合物 ,氨基酸及二肽無反 應(yīng) ,三肽以上才能反應(yīng)。 雙縮脲生成 加熱 ＋ NH3 2 2 H－ 1800 2 2 2 2 2 N 端 C 端 ?評(píng)價(jià)： ?優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好， 10g120g/L線性好，特異性與精密度好，批內(nèi) CV%＜ 2%，顯色穩(wěn)定。 ?缺點(diǎn)：靈敏度較差，對(duì)蛋白質(zhì)含量低的體液標(biāo)本不適合。 ?應(yīng)用：常規(guī)推薦方法。手工或上機(jī)使用。 (Folin試劑法） ?原理： 蛋白質(zhì)分子中的 酪氨酸殘基 和 色氨酸殘基 能夠和 酚試劑中的 磷鎢酸 磷鉬酸 反應(yīng)生成藍(lán)色化合物， Lowry改良法： 在 酚試劑中加入 Cu2+， 提高了呈色的靈敏度，為 雙縮脲法的 100倍左右。吸收峰為 745750nm。 ?評(píng)價(jià)及應(yīng)用： ?優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，改良法靈敏度高（ 10μ g60μg） ，適合測(cè)定蛋白含量少的標(biāo)本。 ?缺點(diǎn)：各種蛋白質(zhì) 酪氨酸 和 色氨酸 比例不同，只適合測(cè)定單一蛋白質(zhì)。受一些藥物干擾。 ?原理： ?評(píng)價(jià)及應(yīng)用： 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便不需特殊儀器。 缺點(diǎn)：濁度形成的干擾因素多（加試劑方法，反應(yīng)溫度，蛋白絮狀沉淀等） 某些酸類（磺基水楊酸等）和血清蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生沉淀，測(cè)其濁度，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，可求蛋白含量。 在酸性環(huán)境下，帶正電的蛋白質(zhì)（ NH3+)與染料的陰離子產(chǎn)生顏色反應(yīng)，使染料的吸收峰改變，可既而用分光光度法比色測(cè)定。 ?原理： 常用染料： 氨基黑，考馬斯亮藍(lán) 等 ? 考馬斯亮藍(lán) G250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì) 色素結(jié)合物在 595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。 ? 蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán) G250結(jié)合在 2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下 1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是 1976年 Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比 Lowry法還高 4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為 0～ 1 000μg／ mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。 ?評(píng)價(jià)及應(yīng)用： ? 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，靈敏度高，且干擾因素少。 ? 缺點(diǎn)：特異性不高；不同蛋白質(zhì)和染料的結(jié)合力不一致，標(biāo)準(zhǔn)物不易確定。 （ 1） 蛋白質(zhì)分子中的 酪氨酸 和 色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白質(zhì)溶液在 280nm處有一吸收峰 。可用于測(cè)定蛋白質(zhì)但需避免核酸干擾。 （ 1） LowryKalcker 公式 蛋白質(zhì)濃度（ mg/ml） = A 280 A 260 （ 2） WarburgChristian 公式 蛋白質(zhì)濃度（ mg/ml） = A 280 A 260 ?原理： ?評(píng)價(jià)及應(yīng)用： ?優(yōu)點(diǎn)：敏感而簡(jiǎn)便，可 保留蛋白生物活性 ，常用與較純的酶和免疫球蛋白。需 紫外分光光度計(jì)及石英比色皿。 ?缺點(diǎn)：各種蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm測(cè)定易受游離色 aa和酪 aa以及尿酸和膽紅素的干擾；核酸在 206nm有最大吸收，在 280nm有較大吸收，導(dǎo)致準(zhǔn)確性和特異性受影響。 ?措施：在 220225nm波長(zhǎng)區(qū)域，用 10002022倍可消除干擾。 ? （ 2） 稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的經(jīng)驗(yàn)公式：蛋白質(zhì)的肽鍵在 200— 250nm有強(qiáng)的紫外吸收。其光吸收強(qiáng)度在一定范圍與濃度成正比，其波長(zhǎng)越短，光吸收越強(qiáng)。若選用 215nm可減少干擾及光散射，用 215nm和 225nm光吸收差值與單一波長(zhǎng)測(cè)定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差，因此，對(duì)稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，可選用 215nm和225nm光吸收差法。 ? 常用下列經(jīng)驗(yàn)公式： 蛋白質(zhì)濃度（ mg/mL） =（ A215A225） 溶解在溶液中的固體可增加溶液的光折射率，在固定波長(zhǎng)和溫度下，光折射率和血清中蛋白質(zhì)含量成正比。 ?原理： ?評(píng)價(jià)及應(yīng)用： ?優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速，易掌握，重復(fù)性較好，適合臨床急診，體檢篩查和胸腹水蛋白質(zhì)測(cè)定。 ?缺點(diǎn)：準(zhǔn)確性較差，易受高血脂癥，高膽紅素血癥以及溶血等因素影響，會(huì)由于 A/G比值變化而產(chǎn)生誤差。 ?參考范圍：成人 60－ 80g/L ?臨床意義： 總蛋白升高： 總蛋白降低：①丟失過多 ②消耗增加 ③白蛋白合成減少 ④水腫 真性升高： MM、巨球蛋白血癥、自身免疫性疾病等 假性升高：機(jī)體明顯失水，總蛋白含量相對(duì)升高， A/G幾乎不變 二、血清白蛋白測(cè)定 ?方法 ： ( 推薦 ) ( 推薦 ) ?原理 : 血清 ALB可通過 離子鍵或疏水鍵 與包括 染料 在內(nèi)的各種有機(jī)離子結(jié)合 ,而 GLB很少結(jié)合外源性染料 ,可在 不分離 ALB與 GLB的情況下直接測(cè)定 ALB。 染料 BCG BCP 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 易于和非人源性白蛋白結(jié)合 與白蛋白結(jié)合特異性較差 與 非人源性白蛋白結(jié)合力弱 與白蛋白結(jié)合特異性好 在 30秒內(nèi)測(cè)可提高特異性 ?應(yīng)用及評(píng)價(jià) : 嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間的 BCG法 既適合 手工 也適合 自動(dòng) 化分析。 臨床上推薦使用 。 ?原理 : 鹽析是由于加入大量的中性鹽破壞了蛋白質(zhì)的 水化膜、 中和其所帶的 電荷 從而使蛋白質(zhì)分子聚集而 沉淀 析出。 各種蛋白質(zhì)的 親水性 和 帶電荷不同 ，故鹽析時(shí)所需 鹽濃度與 pH不同。GLB在生理 pH下帶電荷及水化膜比 ALB少 ，可被較低濃度中性鹽沉淀。 中性鹽： 硫酸銨、硫酸鈉等 ?應(yīng)用及評(píng)價(jià) : 操作繁瑣， 不宜自動(dòng)化，基本不用