醫(yī)學(xué)]07生化技術(shù)ta-資料下載頁
2025-01-04 05:52本頁面
【正文】 需純化： SOUTHERN BLOT NORTHERN BLOT （ DOT BLOT） WESTERN BLOT 防降解 純度、完整性要求低于 RTPCR， 靈敏度低，可靠性高 RTPCR定量特定 mRNA： 靈敏度高 ， 可靠性低 嚴(yán)防污染、降解、試管效應(yīng) RNA要求較純，較完整 不需純化： DNA原位雜交 RNA原位雜交 免疫組化、測生物活性 防降解 不能定量（除活性測定） 可靠性高 特定分子的定量 四 、基因表達(dá)干預(yù) ? ? 用反義 DNA、反義脫氧寡核苷酸、反義 RNA，與相應(yīng) DNA有意義鏈、 mRNA結(jié)合，阻抑從DNA到 mRNA到蛋白質(zhì)整個表達(dá)過程。反義寡核苷酸可與相應(yīng) DNA高嘌呤區(qū)域的雙螺旋結(jié)合，形成三鏈，封閉 RNA聚合酶而抑制轉(zhuǎn)錄，被稱為 三鏈技術(shù) 。 ? ? 是一種特殊的反義 RNA，但它除了封閉基因表達(dá)外還有催化作用，可與互補的 mRNA結(jié)合然后把它切割，切割不斷反復(fù)進(jìn)行，從而破壞翻譯的模板，抑制靶基因表達(dá)。 ? i（ RNA interference）技術(shù) ? 一般是指利用與靶基因互補的雙鏈 RNA片段抑制阻斷靶基因表達(dá)。 RNA i（ RNA interference）技術(shù)產(chǎn)生 ? 1998年， Fire等發(fā)現(xiàn)雙鏈 RNA對同源靶基因表達(dá)的特異阻抑效應(yīng)比單鏈反義 RNA、單鏈有意義 RNA強得多，把這種作用的雙鏈 RNA片段命名為 RNAi。較長的 RNAi可誘發(fā)干擾素系統(tǒng)和非特異阻抑效應(yīng)，造成廣泛的轉(zhuǎn)錄后基因沉默效應(yīng)（ PTGS），對哺乳動物來說，大于30bp RNAi就可產(chǎn)生非特異效應(yīng)。所以用于人類基因治療的 RNAi小于 30bp。 RNAi誘導(dǎo) PTGS的原理 ? 小分子量的 RNA片段 ? ds RNA（小于 30 bp） ? ?轉(zhuǎn)染細(xì)胞 ? ?特異核酸酶 Dicer切割， ATP ? 22nt siRNA ? ?與核酸酶復(fù)合物結(jié)合 ? RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（ iRISC） ? ?ATP ， siRNA解鏈 ? 活化的 RISC（ aRISC） ? ? ? 反義 siRNA與 mRNA結(jié)合 ? ?RISC的核酸酶激活 ? ?切割 mRNA ? mRNA碎片 ? 基因沉默 ds RNA si RNA iRISC aiRISC aRISC m RNA m RNA 五、基因表達(dá)譜技術(shù) mRNA差異顯示法 消減雜交 基因表達(dá)芯片技術(shù) 理論上覆蓋細(xì)胞的所有 mRNA或蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)組學(xué) 第一步 ，分離提純 總 RNA或 Mrna、蛋白質(zhì) 分子生物學(xué)技術(shù)在 分子病理、證的實質(zhì)、分子藥理研究 中的應(yīng)用 ? 蛋白質(zhì)是生命的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命運動的具體執(zhí)行者。蛋白質(zhì)（酶）合成的調(diào)節(jié)是生理調(diào)節(jié)中最基本的調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的缺陷，與很多疾病密切相關(guān) 核酸、蛋白質(zhì)與生理功能的關(guān)系 ? 神經(jīng) ? 內(nèi)分泌 旁分泌 免疫 ? DNA RNA Pr（ 酶） 細(xì)胞 代謝（化學(xué)變化） ? ? ? 生理功能變化 病、證 異常 （ 1）細(xì)胞水平調(diào)節(jié) —— 調(diào)節(jié)有重要功能的蛋白質(zhì) RNA 轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄 翻譯 蛋白質(zhì) 復(fù)制 DNA 復(fù)制 結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)（活性調(diào)節(jié)） —— 分子對接 數(shù)量調(diào)節(jié) 合成 —— 基因表達(dá)調(diào)控 轉(zhuǎn)錄是關(guān)鍵調(diào)控點 ， 決定何時表達(dá)、表達(dá)多少 翻譯是表達(dá)終結(jié)果 降解 —— 基因表達(dá)調(diào)控（降解酶） 功能蛋白 （ 2）激素水平 —— 激素的合成、分泌、與激素受體結(jié)合、 調(diào)節(jié)靶細(xì)胞內(nèi)蛋白活性及基因表達(dá)調(diào)控 內(nèi)分泌細(xì)胞 激素 靶細(xì)胞 激素 受體 （ 3）神經(jīng)水平 —— 遞質(zhì)的合成、分泌、與受體結(jié)合、 調(diào)節(jié)內(nèi)分泌或效應(yīng)器細(xì)胞內(nèi)活性及基因表達(dá)調(diào) 控 神經(jīng)元 神經(jīng)遞質(zhì) 內(nèi)分泌細(xì)胞 效應(yīng)器細(xì)胞 受體 神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò) 信號傳遞 蛋白質(zhì) 縱向：信號傳遞 橫向：基因表達(dá)調(diào)控、基因表達(dá)譜 \蛋白質(zhì)組 代謝 生理功能 基因表達(dá)調(diào)控的調(diào)節(jié)物 正常生理性代謝調(diào)節(jié)物 致病因素 藥物因素：化學(xué)藥、生物藥、中藥及復(fù)方 生物藥物種鑒定、分類、育種 ? DNA多態(tài)性分析， ? rRNA間隔區(qū)長度分析， ? DNA測序 制備昂貴的中藥成分
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