信號轉(zhuǎn)導研究方法(1)-資料下載頁
2025-05-12 05:14本頁面
【正文】 稱之為轉(zhuǎn)基因。 轉(zhuǎn)基因動物： 以實驗方法將外源基因?qū)雱游锶旧w基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。 轉(zhuǎn)基因技術(shù) transgenic technology 轉(zhuǎn)基因動物模型實驗步驟 : ? 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建； ? 將轉(zhuǎn)基因載體導入受精卵細胞或胚胎干細胞； ? 將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細胞植入假孕小鼠子宮內(nèi)； ? 對轉(zhuǎn)基因動物進行鑒定。 轉(zhuǎn)基因載體 結(jié)構(gòu)基因 報告基因 增強子 啟動子 受精 全能性細胞 注射 植入 假孕小鼠 后代 Southern blot RTPCR Western blot 轉(zhuǎn)基因小鼠 基因敲除技術(shù) Gene Knockout ? 體外合成無效基因或突變基因； ? 定向插入 (同源重組 )宿主細胞染色體 DNA中 取代相應(yīng)正?；?, 使特定目的基因在細胞內(nèi)或生物體內(nèi)失活； ? 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動物 ,即為基因敲除動物。 基因敲除技術(shù) Gene Knockout ? 信號轉(zhuǎn)導中第二信使含量的測定 第二信使含量的高低同信號傳遞密切相關(guān)。 1.[Ca2+]的測定： 原子光譜法、離子微電極測定法、放射示蹤法及標記示蹤法等。目前常用標記示蹤法，即用熒光探針標記靶細胞。常用的熒光探針有 quin2/Am、 Fura2/Am及 Indo1等，后二者較為敏感。 ： 采用 3HTdR標記的肌醇標記靶細胞后，用不同的刺激劑刺激細胞，分離磷脂酰肌醇混合物，通過陰離子交換層析柱分離洗脫，收集 IP3洗脫峰后進行液閃測定。此外，還可以使用 Amersham公司生產(chǎn)的 DmyoIP3[3H]分析系統(tǒng)直接測定粗提物中的 IP3含量，此方法簡易、敏感。 ： 首先提取含 DAG的樣品，用 DAG激酶催化底物 DAG，使之發(fā)生磷酸化，外源加入 32γATP，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進行分離后測定放射性含量，根據(jù)標準品計算出樣品中 DAG的含量。 ： （ 1） cAMP[3H]分析系統(tǒng)，其優(yōu)點是放射性半衰期長，可用于大量樣品的分析；（ 2） cAMP[125I]分析系統(tǒng)，用于小量樣品的分析；（ 3） cAMP ELISA測定方法，此方法簡便、敏感。 例如檢測組織或細胞中某個信號通路及其作用 : 1. 樣本（組織，細胞）； 2. 免疫組化，免疫細胞化學定位 3. RTPCR(Realtime PCR), Western blot 檢測通路關(guān)鍵信號分子的表達（ mRNA水平，蛋白水平），磷酸化狀態(tài)； 4. 檢測通路相互作用蛋白（ CoIP等） 6. 關(guān)鍵信號分子基因沉默或增強（沉默：抑制劑 /siRNA/抗體/基因敲除動物；增強：激動劑 /構(gòu)建過表達載體轉(zhuǎn)染） 7. 芯片 /組學檢測 信號通路研究基本策略 例如研究某藥物對細胞的作用及相關(guān)信號通路 : 1. 藥物刺激細胞（時間梯度，濃度梯度）； 2. 檢測藥物對細胞的作用（毒性，增殖，凋亡，侵襲，遷移等）； 3. 共聚焦顯微鏡定位； 4. RTPCR(Realtime PCR), Western blot 檢測通路關(guān)鍵信號分子的表達（ mRNA水平，蛋白水平）），磷酸化狀態(tài)； 5. 檢測通路相互作用蛋白（ CoIP， FRET等） 6. 關(guān)鍵信號分子基因沉默（抑制劑 /siRNA/抗體）后檢測 7. 芯片 /組學檢測 謝謝 信號通路研究基本策略 基因功能研究策略 新發(fā)現(xiàn)的功能未知的基因： ? 通過生物信息學分析對該基因所編碼蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及功能進行預(yù)測 。 ? 應(yīng)用分子生物學技術(shù)在細胞及動物水平進行研究（蛋白表達，細胞定位，沉默或過表達對細胞功能的影響等） 。 ? 通過探討與該基因蛋白相互作用的蛋白而確定新基因的功能。 ? 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析和結(jié)構(gòu)測定 北京旅行社 歐洲旅游 美國旅游 溑煬牷
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