蛋白質(zhì)的wesrern印跡分析-資料下載頁
2025-05-10 09:44本頁面
【正文】 將凝膠浸入考馬斯亮藍染色液中，檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全。 五、轉(zhuǎn)膜 注意事項： （ 1）開始轉(zhuǎn)移時一定要檢查電流大小。過高電流產(chǎn)生的熱量會導(dǎo)致轉(zhuǎn)移失敗，通常高電流是由于轉(zhuǎn)移液配制不當(dāng)造成的。 （ 2）低離子強度轉(zhuǎn)移緩沖液可使用較高電壓，而不會導(dǎo)致高電流和過熱，但轉(zhuǎn)移過程中由凝膠中滲出的電解質(zhì)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移緩沖液電導(dǎo)增加，緩沖能力降低。 （ 3）也可在恒流狀態(tài)下以 200mA轉(zhuǎn)移 2h。 （ 4）若轉(zhuǎn)移中因凝膠變形發(fā)生條帶扭曲或由于凝膠中電解質(zhì)滲出導(dǎo)致過熱，可預(yù)先將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。 五、轉(zhuǎn)膜 （ 5）使用預(yù)先染色的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品或轉(zhuǎn)移后將凝膠染色，可檢查轉(zhuǎn)移是否徹底。 （ 6）對于較大蛋白質(zhì)，較低的丙烯酰胺濃度可獲得較好的轉(zhuǎn)移效果。 （ 7）對電轉(zhuǎn)移來說，最常遇到的問題是目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率低，轉(zhuǎn)移效率可由轉(zhuǎn)移后對凝膠或膜染色來進行觀察。 六、檢測 實驗器材 （ 1）器材：搖床，避光盒，洗膜用平皿， X線片， X線片曝光盒等。 （ 2）試劑： ① 10 TBST緩沖液： 100 mmol/L TrisHCl (pH )，1500mmol/L NaCl， % Tween20，補水至 1000ml，高壓滅菌， 4℃ 保存，使用前稀釋 10倍。 ② 5%脫脂奶粉（ 1 TBST配制）。 ③ 一抗：羊抗 Actin (使用前用 1 TBST稀釋 200倍 )。 ④二抗：兔抗羊 Ig G/HRP (使用前用 1 TBST稀釋 2021倍 )。 ⑤ ECL試劑盒。 六、檢測 實驗方法 （ 1）封閉：將轉(zhuǎn)移后的膜放入 5%（ W/V）脫脂奶粉中，室溫、搖床上緩慢搖動狀態(tài)下封閉 1h(或 4℃ 過夜 ) （ 2）一抗反應(yīng)：①將一抗（羊抗 Actin） 用 1 TBST稀釋 200倍 )；②將封閉后的膜直接放入上述抗體中， 4℃ 反應(yīng)過夜。 （ 3）洗膜：將反應(yīng)膜放入平皿中，用 1 TBST漂洗一次，繼而用 1 TBST洗滌 3次（室溫下緩慢搖動洗滌）以洗凈未結(jié)合的一抗，每次換入新液洗滌 10min。 （ 4）二抗反應(yīng)：①將二抗（兔抗羊 Ig G/HRP ）用 1 TBST稀釋 2021倍；②將經(jīng)一抗作用過的膜放入上述二抗液體中（室溫、避光緩慢搖動）作用 50min(不超過 60min). (5)洗膜：用 1 TBST洗膜，方法同（ 3），洗去二抗。 六、檢測 （ 6）曝光及洗片： ①按 1:1（ V/V）混合 ECL試劑盒中兩種液體，在辣根過氧化物酶（ HRP）催化下，過氧化物酶與 Luminol 增劑反應(yīng)發(fā)強光，可見信號可以用壓片法檢測。 Western 實驗中， HRP標(biāo)記在二抗上，與一抗靶蛋白復(fù)合物結(jié)合，再用底物進行發(fā)光檢測。 ②將上述混合液均勻鋪在 PVDF膜表面，室溫作用 2min，抖掉膜上液體，將膜用保鮮膜包裹（避免在膜的上面出現(xiàn)氣泡） ③在暗室中（紅光下），將 X線膠片直接壓于包裹后的膜上，曝光適當(dāng)時間。 ④將曝光后 X光線片在清水盤中浸濕 → 顯影液中顯影 → 清水中漂洗 → 定影液中定影 5 min（具體曝光時間及顯影時間需根據(jù)顯影結(jié)果作出調(diào)整）。 六、檢測 注意事項： （ 1）選擇合適的一抗及二抗?jié)舛取? （ 2）選擇合適的封閉液。 （ 3）吸取 ECL試劑時要注意更換 Tip尖。兩種試劑一經(jīng)混合，應(yīng)在內(nèi)使用。 （ 4）注意避光操作。 （ 5）應(yīng)考濾 ECL試劑的發(fā)光強度極其衰滅時間，因此請按說明書及實驗具體情況進行。 請批評指證 謝謝
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