【正文】 2 分子篩層析 (molecularsieve chromatography) 也叫凝膠過濾 (gelfiltration) 常用的凝膠： 葡聚糖凝膠 (商品名 Sephadex) 聚丙烯酰胺凝膠 (商品名 BioGel) 瓊脂糖凝膠 (Sepharose) 93 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 94 所用介質(zhì)為 凝膠珠 ,其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) . 一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔只允許相應(yīng)大小的分 子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 ,大分子則被排阻在外 . 洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來 , 洗脫液體積小 。小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿 來穿去 ,歷程長(zhǎng) ,后洗脫下來 ,洗脫體積大 . 3 密度梯度離心 (density gradient centrifugation) 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 95 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University (三 )根據(jù) 電離性質(zhì) 不同的分離方法 電泳法和離子交換層析 :帶電顆粒在電場(chǎng)中向著所帶電荷相反方向移動(dòng)稱為電泳 . 原理 :不同的蛋白質(zhì)因結(jié)構(gòu)、形狀和帶電量的不同而有不同的泳動(dòng)速度 ,從而可以進(jìn)行分析和分離 . 分類：根據(jù)支持物的不同，可分為：薄膜電泳，凝膠電泳 . 96 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University a)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (SDSPAGE) SDS:十二烷基硫酸鈉 ,變性劑 普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比 : 凈電荷 ,大小 ,形狀 用 SDS和巰基乙醇 (打開二硫鍵 )處理 蛋白質(zhì)變性并與 SDS結(jié)合 ,形成 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物 ,使蛋白質(zhì)分子均帶負(fù)電 . SDS/1g 此方法只能測(cè)得 亞基肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量 97 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 十二烷基硫酸鈉 Sodium dodecyl sulfate 分子式： CH3(CH2)11OSO3Na 分子量： C12H25NaO4S= 性狀：白色或淺黃色結(jié)晶或粉末 . 熔點(diǎn)： 180℃ （分解） . 十二烷基磺酸鈉 Sodium dodecyl sulfonate 分子式： CH3(CH2)11SO3Na 分子量： C12H25NaO3S= 性狀：白色或淺黃色結(jié)晶或粉末 . 熔點(diǎn)： 300℃ . 98 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 水平式電泳裝置 垂直式電泳裝置 99 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University b） 等電點(diǎn)聚焦電泳 （ IFE） ：形成 pH梯度 ,不同蛋白質(zhì)聚集到各自等電點(diǎn)位置 . 100 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University C 雙向電泳 第一向 ： 等電聚焦電泳 第二向 ： SDSPAGE 雙向電泳后的凝膠經(jīng)染 色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖： 水平方向反映出蛋白在pI上的差異， 垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e . H b AH b S 胰 蛋 白 酶 2 8 肽 段2 8 肽 段 雙 向 電 泳 層 析101 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University (Ionexchange chromatography) 常用的陽離子交換劑為羧甲基纖維素 (CMC) 陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素 (DEAEC) 102 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University (Ionexchange chromatography) 常用的陽離子交換劑為羧甲基纖維素 (CMC) 陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素 (DEAEC) 103 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University (四 )根據(jù) 配基特異性 的分離純化方法 親和層析法 (affinity chromatography):蛋白質(zhì)和 相應(yīng)配基的親和力具有高度特異性和可逆性特點(diǎn) . 抗原、 Protein A和抗體，酶與底物等 . 104 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 二、蛋白質(zhì)的純度的鑒定 高壓液相層析法 (HPLC) 高壓毛細(xì)管電泳法 (HPCE) 放射免疫分析 (RIA) 酶標(biāo)記免疫分析法 (ELISA) －末端測(cè)序 105 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 三、分子量測(cè)定的方法 根據(jù)氨基酸的數(shù)目 20種氨基酸的平均分子量為 128 肽鍵個(gè)數(shù) =縮合失水分子數(shù) =氨基酸分子總個(gè)數(shù)－肽鏈條數(shù) 已知 20種氨基酸的平均分子量是 128，現(xiàn)有一蛋白質(zhì) 分子由兩條多肽鏈組成，共有肽鍵 98個(gè) ,問此蛋白質(zhì) 的分子量最接近于（ ） 11036 106 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 較精確測(cè)定分子量的主要方法有超速離心法、 分子篩層析法、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、生物質(zhì)譜法 等 . 107 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University a）超速離心法 高速離心力作用下 ,蛋白質(zhì)分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周 方向移動(dòng) ,用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白 質(zhì)的離心沉降速度 .蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和 形狀有關(guān) . 沉降系數(shù) 是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度 ,用 s表示 .一個(gè) s單位為 1 1013秒 108 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 相對(duì)分子質(zhì)量越大 ,s值越大 蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)： 1～ 200s 由沉降系數(shù) s可根據(jù)斯維得貝格 〔 Svedberg〕 方程計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量： 109 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University b)分子篩層析法 ,也叫凝膠過濾法 所用介質(zhì)為 凝膠珠 ,其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) . 一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔只允許相應(yīng)大小的分 子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 ,大分子則被排阻在外 . 洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來 , 洗脫液體積小 。小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿 來穿去 ,歷程長(zhǎng) ,后洗脫下來 ,洗脫體積大 . 110 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖 ,商品名 :Sephadex 先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積 〔 Ve〕 以相對(duì)分 子質(zhì)量對(duì)數(shù) (logM)對(duì) Ve作圖 ,得一標(biāo)準(zhǔn)曲線 一定范圍內(nèi) : Ve ＝ K1－ K2logM 再測(cè)出未知樣品洗脫體積 〔 Ve〕 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量 111 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University C） SDSPAGE電泳法： 用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì) 數(shù)值對(duì)它們的遷移 率作圖，測(cè)出待測(cè) 樣品的遷移率，從 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣 品的相對(duì)分子量 . d)生物質(zhì)譜法 更準(zhǔn)確的分子量測(cè)定方法 112 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University 四、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定 (Kjedahl) 酚試劑法 (Lowry)， 25～ 250 μg/mL ， ～ 10 mg/mL 280nm有最大吸收 蛋白質(zhì)濃度 (mg/mL)=( A280 A260) 稀釋倍數(shù) 113 2022年 5月 30日 8時(shí) 54分 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 School Pharmacy of Yantai University .蛋白質(zhì)將 Cu2+還原為 Cu+再和BCA(4,4二羧酸 2,2二喹啉鈉 )反應(yīng)生成紫色物質(zhì) .562nm讀數(shù) .101000μg/mL .考馬斯亮藍(lán) G250與蛋白質(zhì)結(jié)合后由淡紅色變成藍(lán)色化合物 ,595nm讀數(shù) .25200μg/mL. 速度快重復(fù)性好 讀數(shù)法都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線 114