蛋白質(zhì)的wesrern印跡分析(編輯修改稿)
2025-06-15 09:44 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 四、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電脈 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。 SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按雙丙烯酰胺：丙烯酰胺為了 1： 29配制，實(shí)驗(yàn)表明它能分離大小相差只有 3%的多肽。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電脈成功的關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)與 SDS的結(jié)合程度。影響它們結(jié)合的因素主要有三個(gè)： （ 1） 溶液中 SDS單體的濃度 SDS在水溶液中是以單體和 SDS多肽膠束的混合形式存，能與蛋白質(zhì)分子結(jié)合的是單體。單體的濃度與 SDS總濃度、溫度和離子強(qiáng)度有關(guān)。 （ 2） 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度 SDSPAGE的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，常為 10～ 100mmol/L (3) 二硫鍵是否完全被還原 只有二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚， SDS才能定量地結(jié)合到亞基上，使蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。 四、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電脈 實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)材料 （ 1） 器材： 垂直電泳槽，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 /電轉(zhuǎn)儀，蛋白變性用加熱儀器， Tip頭， Ep管，碎冰，注射器等。 （ 2） HCl (PH )。 (3) HCl (PH )。 (4) 10%SDS室溫保存：去離子水配制。 （ 5） 10%過(guò)硫酸銨（保存）：提供驅(qū)動(dòng)丙酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。由于過(guò)硫酸銨會(huì)緩慢分解，應(yīng)隔周新鮮配制。 四、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電脈 （ 6） TEMED（ N， N， N， N’四甲基乙二胺）：催化過(guò)硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合。 （ 7） 5 Tris甘氨酸電泳緩沖液（ 1000ml）：去離子水500ml， Tris 堿 ，甘氨酸 94g, 10%(W/V)電泳級(jí) SDS 50ml，補(bǔ)去離子水至 1000ml。使用前做 5 稀釋 （ 8） 4 蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液 （ 9）蛋白質(zhì)預(yù)染 Marker 四、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電脈 實(shí)驗(yàn)方法 制備 SDSPAGE凝膠 （ 1）準(zhǔn)備 SDSPAGE凝膠電泳用玻璃板夾板 （ 2）配制 10% SDSPAGE分離膠（ 15ml） (3) 灌制分離膠 （ 4）立即用 %SDS液覆蓋膠面（隔絕空氣有助于凝膠聚合，使凝膠面形成平直），室溫放置約 40min至分離膠凝固。 （ 5）配制 5%濃縮膠 4ml (可以與配制分離膠時(shí)同時(shí)進(jìn)行 ) 四、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電脈 （ 6） 倒掉（吸附） %SDS覆蓋液，用去離子水沖洗分離膠表面 3～ 4次，以洗凈未聚合的丙烯酰胺（避免在膠頂部或玻璃夾板中留有氣泡），并用吸水紙吸掉殘留的液體。 （ 7） 將凝膠板重新垂直放置，輕輕加入 5%積層膠液（注意避免產(chǎn)生汽泡），插入樣品梳，使液面至樣品梳上標(biāo)志位置，室溫凝膠約 40min. (8) 輕輕拔去梳子，撕去封玻璃夾板用透明帶，將玻璃夾板 “ 凹 ” 面緊貼緊電泳槽，兩側(cè)用夾子很好地固定在電泳槽上。用針頭式注射注射器吸取電泳緩沖液輕輕沖洗點(diǎn)樣孔，以去除未聚合的凝膠，待上電泳。 四、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電脈 樣品變性及電泳 （ 1）由 80℃ 冰箱取出 Hela細(xì)胞總蛋白樣品，立即插入冰中（減少蛋白降解）待其融化。 （ 2）吸取細(xì)胞總蛋白樣品 15 ul 加入 ul EP管中，每樣品管中分別加入 5ul 4 蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，輕輕混合， 98℃ 變性8min（同時(shí)變性標(biāo)準(zhǔn)分子量 Ma
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