蛋白質(zhì)的wesrern印跡分析(已修改)
2025-05-26 09:44 本頁面
【正文】 蛋白質(zhì)的 Western印跡分析 劉二戰(zhàn) 一、原理 一個基因表達(dá)的最終產(chǎn)物是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白，因此檢測蛋白是測定基因表達(dá)的主要標(biāo)志。 原理： Western Blotting 是將獲得的蛋白質(zhì)樣品通過 SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離；并通過轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非標(biāo)記抗體（一抗）與轉(zhuǎn)印后膜進(jìn)行雜交，使其與膜上的靶蛋白特異性結(jié)合；再與經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，最后用 ECL試劑反應(yīng)，經(jīng) X線片曝光、顯影等一系列反應(yīng)，檢測蛋白質(zhì)等生物大分子。 二、方法 樣品蛋白的制備 SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳 轉(zhuǎn)膜 檢測 三、樣品蛋白的制備 原理： 蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識，但基本原理只有兩個方面： 一是用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑提取、層析和結(jié)晶等； 二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使備組分分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳、超速離心、超濾等。 三、樣品蛋白的制備 蛋白質(zhì)制備的步驟 （ 1） 選擇材料和預(yù)處理 （ 2）細(xì)胞的破碎及細(xì)胞的分離 （ 3）提取和純化 （ 4）濃縮、干燥和保存 三、 樣品蛋白的制備 培養(yǎng)細(xì)胞中蛋白質(zhì)樣品的提取 提取細(xì)胞蛋白多是利用將細(xì)胞裂解、破碎、使蛋白質(zhì)釋放的原理，在提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中要考慮到細(xì)胞裂解液的 pH、去污劑的類型和濃度，以及二價(jià)陽離子、輔助因子等因素，同時(shí)為防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制劑。 三、樣品蛋白的制備 實(shí)驗(yàn)材料 （ 1）器材： 冷凍離心機(jī)， 細(xì)胞刮， Tip頭、 、 滅菌 Ep管，碎冰。 （ 2）試劑： ① 細(xì)胞總蛋白裂解液（ 100ml） : 1 PBS 80ml， Triton100 1ml, 去氧膽酸鈉 , SDS , 補(bǔ) 1 PBS緩沖液至100ml。 ② PMSF貯存液（ PMSF ）： PMSF（苯甲基磺酰氟）在水溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)在臨用前向不含 PMSF的裂解緩沖液中加入 PMSF貯存液 100ul,使其終濃度為 。 （ 3） Hela 細(xì)胞 三、 樣品蛋白的制備 實(shí)驗(yàn)方法 （ 1） 洗滌細(xì)胞：選取細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的 Hela細(xì)胞，由 37℃取出后放入冰盤中，預(yù)冷。吸棄原培養(yǎng)液，用 4 ℃ 預(yù)冷的1 PBS洗細(xì)胞表面 3～ 4次，除凈培養(yǎng)基中的血清，并盡量吸棄細(xì)胞培養(yǎng)皿中殘余的 PBS。 （ 2） 向培養(yǎng)皿中加入蛋白裂解液 (100ul/60mm)，輕輕晃動，使裂解液均勻鋪于細(xì)胞表面。 （ 3） 冰浴 30～ 60min，期間晃動 3～ 4次。 （ 4） 用細(xì)胞刮子集中裂解液，收集入冰上預(yù)冷的 Ep 管中， 4 ℃ 離心， 12021g 20min. （ 5） 小心吸取上清液入新的預(yù)冷管中（為避免反復(fù)凍融導(dǎo)致蛋白降解，可按需要將其分裝使用）， 80 ℃ 保有存?zhèn)溆茫杀４?1年） 三、 樣品蛋白的制備 注意事項(xiàng) （ 1） 注意個人防護(hù)： PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過
試題試卷相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1