實驗九聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點-資料下載頁
2024-09-01 11:28本頁面
【導(dǎo)讀】到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。生物大分子分開。變性作用，其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。中，至離上端1cm處，再用注射器緩緩加水3-5mm高。避免管下有氣泡。上槽接電泳儀的正極，下槽。液，在凝膠條的正極端插一銅絲為標記。用灌滿水的注射器。長針頭插入凝膠與玻管管壁之間，邊壓水邊慢慢轉(zhuǎn)動玻管，放入染色液中同時進行固定染色1-2h，用蒸餾水漂洗數(shù)次后用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，試管中，浸泡過夜。次日用酸度計分別測定每管浸提液的pH. 以凝膠長度為橫坐標，pH值為縱坐標，繪制標準pH梯度。計算出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正極端的實際長度后，直接從pH梯度曲線上求出該蛋白質(zhì)等電點。鹽離子可干擾pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲。小顆粒引起拖尾。及檢測方法的靈敏度。如用考馬斯亮藍R-250. 染色，加樣量可為50-150?g；如用銀染色，mg/mL為宜，最適當(dāng)加樣體積為10-30?簡述聚丙烯酰胺等電聚焦電泳的基本原理。
【正文】 長度 固定染色后凝膠條長度 計算出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正極端的實際長度后 ，直接從 pH梯度曲線上求出該蛋白質(zhì)等電點 。 五、注意事項 (1) 鹽離子可干擾 pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲 。 為防止上述影響 ， 進行 IEFPAGE時 ， 樣品應(yīng)透析或用 SephadexG25脫鹽 ， 也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解 ， 以免不溶小顆粒引起拖尾 。 (2) 加樣量則取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類 、 數(shù)目以及檢測方法的靈敏度 。 如用考馬斯亮藍 R250染色 ， 加樣量可為 50150 ?g；如用銀染色 ，加樣量可減少到 1 ?g。 一般樣品濃度以 mg/mL為宜 ， 最適當(dāng)加樣體積為 1030 ?l。 六 、 思考題 (1)簡述聚丙烯酰胺等電聚焦電泳的基本原理 。 (2)進行聚丙烯酰胺等電聚焦電泳時的注意事項有哪些？
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