20xx年醫(yī)學專題—膜蛋白的提取與分離資料(編輯修改稿)
2024-11-17 22:28 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白，方便迅速。到目前為止，提取膜蛋白仍然是蛋白學的一個瓶頸。分離膜蛋白的方法（操作）1）分離細胞膜蛋白的方法：1冰上刮下細胞后將細胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液A中，于室溫與液氮罐中反復凍融2次。2 5000轉4度離心，驅除核及未裂解的細胞。3取上清12000轉4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液B中。4 12000轉4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液C中提取后測蛋白濃度,SDSPAGE電泳，分裝后20度保存?zhèn)溆?。buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,20uM pmsf(PH=)buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,20uM pmsf(PH=) 1mM EGTAbuffer C : ,20uM pmsf,50mMTriscl(PH=),2）分離細胞膜蛋白的方法：細胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min刮下單層細胞，4度下10 000g 5min離心溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min收集水相留作分析用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心按步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相，并進行免疫沉淀實驗試劑：2%tritonX114:2%TritonX1150mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）buffer C10mmol/L Tris HCl()150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA()3）分離細胞膜蛋白的方法：7M urea2M thiourea4%chaps%sb3101000000個細胞，可用此buffer 1ml。冰浴勻漿。冰上置30分鐘。4度高速低溫離心30min。取上清20保存。4）分離組織膜蛋白的方法：取組織，加入10ml Buffer A于冰上充分勻漿。J6HC離心機800rpm，4℃離心10min后，所得上清液轉入超速離心管。100000g，4℃離心1hr。棄去上清，沉淀用適量的Buffer B重懸，冰上孵育2hr后分裝至EP管，Eppendorf臺式離心機10000rpm，4℃離心30min。
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