20xx年醫(yī)學(xué)專題—膜蛋白的提取與分離資料(專業(yè)版)
【正文】 原理：4度時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX114水溶液，但在37度時(shí)，此溶液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。6．700kg離心90min，～。③20ml預(yù)冷的TrisMg緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預(yù)冷的TrisMg緩沖液。4）分離組織膜蛋白的方法：取組織，加入10ml Buffer A于冰上充分勻漿?？偟母惺埽杭?xì)胞的量要很充足。差速離心。1935年Danielliamp。獲得大量有生物學(xué)活性的質(zhì)膜蛋白對(duì)我們顯得非常的重要。利用原子散射法研究cAMP的分離機(jī)制發(fā)現(xiàn)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達(dá)到分級(jí)分離的目的。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min刮下單層細(xì)胞，4度下10 000g 5min離心溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min收集水相留作分析用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心按步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相，并進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)試劑：2%tritonX114:2%TritonX1150mmol/L Tris HCl（pH7。5）分離組織膜蛋白的方法：RIPA1XPBS1%NP40%SDS以下用時(shí)加入10mg/ml PMSF異丙醇（終濃度10ul/ml）Aprotinin（30ul/ml）1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml）冰凍組織100mg/細(xì)胞1000000個(gè)，可用RIPA buffer 1ml。根據(jù)公式：蛋白濃度(mg/ml)= D260測(cè)定外膜蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至40ug/ul，該蛋白質(zhì)樣品70℃貯存。棄沉淀。內(nèi)容總結(jié)
（1）膜蛋白的提取與分離
9。棄沉淀。重復(fù)⑦、⑧兩步。Buffer B：20mM HEPES（PH ），10%甘油，2% Triton X100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。4 12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液C中提取后測(cè)蛋白濃度,SDSPAGE電泳，分裝后20度保存?zhèn)溆谩? )膜蛋白色譜(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP+分離強(qiáng)疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去
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