20xx年醫(yī)學(xué)專題—膜蛋白的提取與分離資料-在線瀏覽
2024-11-17 22:28本頁面
【正文】 有膜蛋白的粗組分。差速離心。收集37%與41%間的成分，即為質(zhì)膜部分。都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來，但在某些情況下，但如果蛋白質(zhì)是用于測(cè)序的， X100在280nm處有吸收，如果某蛋白質(zhì)的測(cè)試與280nm處的吸收有關(guān)，就應(yīng)避免使用這類去垢劑.將膜制劑與胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞核分離后，而無需考慮胞質(zhì)蛋白、無論在種類上還是數(shù)量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（5000Da）%，所以充分的膜蛋白的提取，可靠，但有時(shí)含有其他蛋白。利用此性質(zhì)可提取膜蛋白。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(tuán)（P端），又具有陽離子鈣（C端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量有關(guān)。層析柱提?。▍⒉襟E） 4)順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。5)centrifugal protein extraction. 離心的原理：高滲的蛋白裂解液讓細(xì)胞溶漲破裂后，超高速離心評(píng)價(jià)：盡管分級(jí)(胞漿和胞膜)之間有清洗的步驟, MP教授在1998年electrophoresis上發(fā)表的分級(jí)抽提法減去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(極難溶蛋白),在操作上也作了簡(jiǎn)化,總而言之是一種不錯(cuò)的方法。例如，去掉細(xì)胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。總的感受：細(xì)胞的量要很充足。純化蛋白質(zhì)濃度的定量測(cè)定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白，方便迅速。分離膜蛋白的方法（操作）1）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：1冰上刮下細(xì)胞后將細(xì)胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液A中，于室溫與液氮罐中反復(fù)凍融2次。3取上清12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液B中。buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,20uM pmsf(PH=)buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,20uM pmsf(PH=) 1mM EGTAbuffer C : ,20uM pmsf,50mMTriscl(PH=),2）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：細(xì)胞放在冰上，去除上清，用pH7。5）、蛋白酶抑制劑緩沖液A（含0。冰浴勻漿。4度高速低溫離心30min。4）分離組織膜蛋白的方法：取組織，加入10ml Buffer A于冰上充分勻漿。100000g，4℃離心1hr。收集所得上清液即為膜組份。冰上預(yù)冷。冰上預(yù)冷。冰浴勻漿。4度高速離心30min，20000轉(zhuǎn)低溫離心最佳。6）分離細(xì)菌膜蛋白的方法：①于20ml營養(yǎng)肉湯中過夜培養(yǎng)細(xì)菌，37℃，200rpm。③20ml預(yù)冷的TrisMg
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