【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 七十四頁(yè)。,二 非機(jī)械(jīxi232。)法,非機(jī)械方法很多 1 酶解 2 化學(xué)法溶胞 3 物理法 滲透壓沖擊 凍結(jié)和融化 干燥(gānz224。o)法 其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。,二,34,第三十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。,1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理(chǔlǐ)菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。 1）外加酶法,35,第三十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。,外加(w224。ijiā)酶法,酶解法的特點(diǎn)(t232。diǎn)是專一性強(qiáng)，因此在選擇酶系統(tǒng)時(shí)，必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來(lái)選擇。 溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的β1,4糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁的裂解。革蘭氏陽(yáng)性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對(duì)于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用溶菌酶無(wú)效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。 放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽(yáng)性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。 植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。,36,第三十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。,外加(w224。ijiā)酶法,有時(shí)(yǒush237。)采用幾種酶的混合物會(huì)產(chǎn)生更好的效果，加入時(shí)需確定相應(yīng)的次序。 對(duì)酵母細(xì)胞采用酶法破碎時(shí)，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。,37,第三十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。,酶解法(jiě fǎ)的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 發(fā)生酶解的條件溫和(wēnh233。) 能選擇性地釋放產(chǎn)物 胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整,缺點(diǎn)： 溶酶價(jià)格高， 溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶) 產(chǎn)物抑制(y236。zh236。)的存在。,38,第三十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。,酶解自溶作用(zu242。y242。ng),自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代謝過(guò)程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)下去。 自溶作用：改變其生長(zhǎng)環(huán)境（溫度、ｐＨ、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。 缺點(diǎn)是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大(zēnɡ d224。)，過(guò)濾速度下降。,39,第三十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。,某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透(sh232。nt242。u)性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透(sh232。nt242。u)出來(lái)。,2 化學(xué)(hu224。xu233。)滲透法（Chemical permeation）,該法取決于化學(xué)試劑的類型以及(yǐj237。)細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。,40,第四十頁(yè)，共七十四頁(yè)。,酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 堿能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。 成本低，反應(yīng)激烈(jīli232。)，不具選擇性。,（1）酸、堿處理(chǔlǐ)法,41,第四十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。,細(xì)胞破碎常用的表面活性劑： 十二烷基(w225。n jī)硫酸鈉（SDS，陰離子型）；。 非離子型如Triton X100和吐溫（Tween）等 對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。,（2）表面(biǎomi224。n)活性劑,無(wú)論表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，都是兩性(liǎngx236。ng)的，既能和水作用也能和脂作用， 能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,42,第四十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。,能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)(w249。zh236。)被釋放出來(lái)。 有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等,（3）有機(jī)溶劑,（4）EDTA螯合劑,處理G細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞壁外層有破壞作用。 G細(xì)菌的壁外層結(jié)構(gòu)通常靠二價(jià)陽(yáng)離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持(w233。ich237。)，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。,43,第四十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。,通用性差； 時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)50%； 有些化學(xué)試劑有毒。 化學(xué)試劑的加入常會(huì)給隨后(su237。h242。u)產(chǎn)物的純化帶來(lái)困難， 并影響最終產(chǎn)物純度,化學(xué)(hu224。xu233。)滲透法特點(diǎn)：,缺點(diǎn)(quēdiǎn),對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)； 細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。,優(yōu)點(diǎn),44,第四十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。,3 物理(w249。lǐ)法,滲透壓沖擊(chōngjī)法 凍結(jié)融化法 干燥法,45,第四十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。,1）滲透壓沖擊(chōngjī)法,滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法， 將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于(y243。uy)滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于(y243。uy)滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。 僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。,46,第四十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。,2）凍結(jié)(d242。ngji233。)融化法,將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約15℃），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁(p242。 b236。)作用。 一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能， 另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，