【正文】 放,50,第五十頁，共七十四頁。)或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。njiū)方向,多種破碎(p242。而單獨采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有32%。)的研究方向 與上游過程相結(jié)合,在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)（如pH、溫度、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、稀釋率等）等因素都對細胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成有一定的影響。,（ inclusion bodies IBs),3.3 基因工程(jīyīn gōngch233。)→目標(biāo)蛋白變性溶解→復(fù)性→純化。i)在大腸桿菌中的積累,55,第五十五頁，共七十四頁。 高表達產(chǎn)生的積聚物在細胞內(nèi)部形成不溶物原因？ 蛋白過量積聚，超過溶解度，導(dǎo)致沉淀； ②蛋白生成太快，分子間疏水基團相互作用而聚集沉淀； ③蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯誤連接導(dǎo)致沉淀； ④表達蛋白過多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài) ⑤蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。bāo)破碎,包涵體的洗滌,目標(biāo)蛋白的變性溶解,目標(biāo)蛋白的復(fù)性,包涵體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機理研究提出了新的課題。d233。,特點:是利用了包涵體與細胞碎片的密度差，用離心法將包涵體與細胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得了干凈的包涵體，再對包涵體溶解復(fù)性。從這個角度上講，包涵體的形成對分離純化亦有好處。n)1 的特點,59,第五十九頁，共七十四頁。d233。ng)了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)。xi224。xu233。ngjiě)包涵體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時間，比前兩者更適合于實驗室操作。n)三：,63,第六十三頁，共七十四頁。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。xū)溶解到液相中，才能進一步純化。 影響變性因素：時間、pH、離子強度、變性劑種類和濃度。 fen)變性劑被除去后，蛋白質(zhì)會重新折疊成具有活性的正確構(gòu)型，該過程稱復(fù)性。biāo)蛋白的復(fù)性,66,第六十六頁，共七十四頁。 堿性下通空氣。,懸浮(xu225。,1. 包涵體的洗滌 ① 粗制包涵體用 50mM磷酸鹽緩沖液，含150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v) 洗滌23次； ② 用含有1M NaCl的磷酸(l237。,3. 包涵體復(fù)性（間歇式流加稀釋復(fù)性法） 以含DTT和ZnSO4的TrisHCl為復(fù)性緩沖液，再添加0.4M LArg，0.5M尿素，0.5M NaCl作為蛋白(d224。,70,第七十頁，共七十四頁。)（牛生長激素分離提?。?72,第七十二頁，共七十四頁。,73,第七十三頁，共七十四頁。微生物（細菌(x236。一般認為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),。73,第七十四頁，共七十四頁。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式?？梢圆捎脝未瓮ㄟ^勻漿器或多次循環(huán)通過等方式。ir243。 su236。nɡ suō)后蛋白 金屬親和層析 吸附 洗滌： 40mmol/L咪唑，洗除非特異性吸附的雜蛋白 洗脫： 100mmol/L咪唑 目標(biāo)蛋白 純度達95%以上（由SDSPAGE和RPHPLC鑒定） 收率75%,71,第七十一頁，共七十四頁。i)聚集抑制劑， 變性溶解液可多次流加，每次流加的時間是以上一次流加蛋白已達到部分復(fù)性為準(zhǔn)。,2. 包涵(bāo hɑn)體的變性溶解 ① 洗滌后包涵體用含有30mM DTT（二硫代蘇糖醇）及5mol/l鹽酸胍的Tris 緩沖液 pH =8.0 (1:5 w/v)變性溶解 → 室溫攪拌2h，95%以上的包涵體可被溶解； ② 離心，13000rpm，20min → 棄沉淀得到溶解液。)破壁,PBS,洗滌(xǐd237。,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡(diāo w225。zǐ)強度； 氧化還原條件。 膜分離法除變性劑 － 透析、超濾、電滲析。,原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)被破壞，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵沒有破壞。 常用變性劑： ▲ 58 mol/L鹽酸胍和68 mol/L尿素, 作用：破壞離子間相互作用； ▲ 表面活性劑如12％ SDS， 作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用。,64,第六十四頁，共七十四頁。 洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時會與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。,路線(l249。bāo)碎片,除變性劑復(fù)性,62,第六十二頁，共七十四頁。,包涵體獲得 幾種常見的工藝(gōngy236。 缺點：細胞碎片和包涵體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。,路線（二）應(yīng)用(y236。)路線（二）,機械(jīxi232。,路線(l249。zh236。n jiānɡ)、高速珠磨）,離心提取(t237。,57,第五十七頁，共七十四頁。,基因工程包涵(bāo hɑn)體的純化方法,收集(shōuj237。目標(biāo)蛋白一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性。,外源蛋白(d224。 胞內(nèi)表達： 胞內(nèi)可溶性表達：離心,收集菌體→細胞破碎→離心，收集上清→純化 胞內(nèi)周質(zhì)表達：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標(biāo)物→離心,收集上清液→純化。uqī)，加入某些能抑制或阻止細胞壁物質(zhì)合成的抑制劑(如青霉素)，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，新分裂的細胞其細胞壁有缺陷，利于破碎； 選擇較易破碎的菌種作為寄主細胞，如革蘭氏陰性細菌； 用基因工程的方法對菌種進行改造，如在細胞內(nèi)引進噬菌體基因，培養(yǎng)結(jié)束后，控制一定條件（如溫度等），激活噬菌體基因，使細胞自內(nèi)向外溶解，釋放出內(nèi)含物。,破碎技術(shù)(j236。)方法相結(jié)合,化學(xué)法、酶法、機械法相(fǎ xiānɡ)結(jié)合。,51,第五十一頁，共七十四頁。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細胞質(zhì)內(nèi)時，則需采用強烈的機械破碎法． 當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細胞膜或細胞壁結(jié)合的