【正文】 碎法,化學破碎,有機溶劑： 表面活性劑： 酸堿,酶促破碎,自溶法 外加酶制劑法,通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。)法,機械破碎法又可分為 高壓勻漿(y細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細胞破碎。i)較多： WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi,高壓(gāoyā)勻漿機,21,第二十一頁，共七十四頁。 在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。ng)的范圍,—大規(guī)模細胞破碎的常用方法(fāngfǎ) 高壓勻漿法適用的范圍： 酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎； 料液細胞濃度可以很高，20%左右。 在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55－70Mpa。bāo)破碎因素,24,第二十四頁，共七十四頁。 細胞破碎是由于冰晶體在受壓時的相變，包埋在冰中的細胞變形所引起的。,2）珠磨法 bead mill,珠磨是常用的方法 細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。,高速珠磨機(m243。 由于操作過程中會產(chǎn)生熱量， 故磨室還裝有冷卻夾套，以冷 卻細胞懸浮液和玻離小珠。n x237。 由于交錯的運動，提高了破碎效率。),超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的1525kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。)和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。)的機理,JY92II D超聲波 細胞(x236。 操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進行。)的適用范圍,超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。 超聲波破碎的有效能量利用率極低 由于對冷卻的要求相當苛刻，所以不易放大，但在實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。nɡ)機械破碎方法的比較,32,第三十二頁，共七十四頁。xu233。o)法 其中酶法和化學法溶胞應用最廣。,外加(w224。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。,36,第三十六頁，共七十四頁。 對酵母細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。zh236。y242。 缺點是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大(zēnɡ d224。nt242。,2 化學(hu224。,40,第四十頁，共七十四頁。)，不具選擇性。 非離子型如Triton X100和吐溫（Tween）等 對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。,能分解細胞壁中的磷脂，使細胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)(w249。 G細菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持(w233。,通用性差； 時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%； 有些化學試劑有毒。xu233。lǐ)法,滲透壓沖擊(chōngjī)法 凍結(jié)融化法 干燥法,45,第四十五頁，共七十四頁。uy,2）凍結(jié)(d242。)作用。,使細胞結(jié)合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。 冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì),3）干燥(gānz224。 su236。,選擇性釋放目標產(chǎn)物的一般(yībān)原則,⑴僅破壞或破碎存在目標產(chǎn)物的位置周圍 當目標產(chǎn)物存在于細胞膜附近時，可采用較混和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)－融化法等。 (2)機械破碎法和化學法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標產(chǎn)物釋放率條件下，降低細胞的破碎程度。 su236。 有機溶劑與凍融法、干燥法結(jié)合,52,第五十二頁，共七十四頁。 在生長后期(h242。ng)包涵體的純化,基因工程菌培養(yǎng)液不同表達形式的前處理 胞外分泌型表達：離心,收集液相→濃縮→純化。,54,第五十四頁，共七十四頁。,包涵體：一種(yī zhǒnɡ)蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌體蛋白等。,包涵(bāo hɑn)體的構(gòu)成,56,第五十六頁，共七十四頁。 欲獲得天然活性態(tài)的目標產(chǎn)物，必需分離包涵體后，溶解包涵體并使其中的目標蛋白恢復應有的天然活性。) 幾種常見的工藝路線(一),機械破碎 (高壓勻漿(y 優(yōu)點：擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)(z225。 缺點:要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分的細胞碎片，加工時間較長。,包涵體獲得 幾種常見的工藝(gōngy236。)包涵體,加變性劑溶解包涵體,除變性劑復性,60,第六十頁，共七十四頁。 優(yōu)點是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。n)2 的特點,61,第六十一頁，共七十四頁。)破碎 （加變性劑）,離心除細胞(x236。 缺點是所有的可溶性雜質(zhì)都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來困難。,1）包涵(bāo hɑn)體的洗滌 細胞破碎后，包涵體呈顆粒狀，致密。 洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達產(chǎn)物為原則。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。,65,第六十五頁，共七十四頁。 復性方法： 稀釋法除變性劑 － 加入大量水或緩沖液。,蛋白質(zhì)復性影響因素： 變性劑濃度 目標蛋白濃度； pH和離子(l237。,67,第六十七頁，共七十四頁。nfn suān)緩沖液洗滌1次 (1:3 w/v)，將粘附其表面的大部 分蛋白及水溶性雜質(zhì)除去； ③ 用6M尿素及0.5%TritonX100 聯(lián)合洗滌1次 (1:3 w/v)，去除另一些 雜蛋白，這時得較純包涵體（純度達80%左右）； ④ 用SDSPAGE電泳檢測純度。nb225。,5. 復性后純化 復性濃縮(n243。,思考題,常用的細胞破碎(p242。,內(nèi)容(n232。jūn)/酵母/真菌）胞內(nèi)、胞外。植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂