【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2009 [3]陳慧 基因工程技術(shù)在食品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、風(fēng)味改良中的應(yīng)用 牧與飼料科學(xué) 2010 31（4）2728 [4]賈志杰 我國(guó)基因工程藥物研究與應(yīng)用新進(jìn)展 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào) 2010 26（2）290291 [5]翟中和 《生命科學(xué)和生物技術(shù)》 山東教育出版社 1996 [6]鄭明剛 基因工程在生物柴油原料中的應(yīng)用研究 農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué) 2010 2226 [7]方陵生 源自基因工程的新一代生物燃料 世界科學(xué) 2009 810 [8]趙宏韜 淺析基因工程倫理中的有利原則 東方企業(yè)文化 2010 202 [9]閆新甫 《轉(zhuǎn)基因植物》 2002 [10]韋凱 植物基因工程的應(yīng)用及其發(fā)展 魅力中國(guó) 2009 45第四篇：基因工程論文學(xué)號(hào)：13054107基因工程結(jié)課論文院（系）名稱(chēng)： 理學(xué)院 專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)： 生物科學(xué) 學(xué)生姓名： 姜己玉 所在班級(jí)： 131目錄摘要............................................................................................................................................2 第一章 緒論..............................................................3 1..1RNAi的研究進(jìn)展....................................................3 ...........................................3 RNAi 的特點(diǎn)..................................................3 siRNA簡(jiǎn)介.........................................................3 s iRNA 的設(shè)計(jì)原則..........................................3 用于 RNA i 的載體....................................................4 載體的選擇..................................................4 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的.................................................4 MRP1 的研究進(jìn)展......................................................4 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法.....................................................5 實(shí)驗(yàn)材料.............................................................5 宿主菌.............................................................5 載體通用引物................................................5 主要儀器..........................................................5 試驗(yàn)方法.........................................................5 shRNA 的設(shè)計(jì)與退火..................................................5 合成干涉片段的退火..........................................6 重組載體的構(gòu)建..............................................6 菌落PCR初步篩選陽(yáng)性重組子..................................7 測(cè)序鑒定重組載體...............................................7 第三章 結(jié)果與分析.........................................................8 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后膠回收結(jié)果...........................8 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后結(jié)果.............................8 目的片段的回收................................................8 重組質(zhì)粒的菌落PCR...................................................8 重組質(zhì)粒大量提取......................................................8 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果.................................................8 參考文獻(xiàn)..................................................................9摘 要癌癥嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)?；熥鳛槠涑Ｒ?guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性（multidrug resistance, MDR）是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化療失敗的主要原因。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白1（Multidrug Resistanceassociated Protein 1，MRP1）的過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達(dá)的技術(shù)，如能通過(guò)RNAi技術(shù)沉默MDR1基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎(chǔ)。目的：。構(gòu)建針對(duì)mrp1 mRNA的RNA干擾表達(dá)載體。方法：，構(gòu)建靶向mrp1 siRNA重組質(zhì)粒。 DH5α后大量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落 PCR和 DNA測(cè)序分析檢測(cè)重組載體構(gòu)建結(jié)果。結(jié)果：。為下一步抑制mrp1基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：RNA干擾；MRP1；；穿梭載體第1章 緒 論 RNAi的研究進(jìn)展RNA干擾(RNA interference , RNAi)是由雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程，為一種雙鏈RNA分子在mRNA 水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達(dá)的過(guò)程，是一項(xiàng)新興的基因阻斷技術(shù)。RNAi有望成為分析人類(lèi)基因組功能的有力工具，在腫瘤病因、免疫機(jī)制及治療等方面的研究上有廣闊的發(fā)展前景。 RNAi的分子作用機(jī)制RNAi的作用機(jī)制在眾多學(xué)者的努力研究下日漸明朗。不同生物體內(nèi)的RNA干擾作用機(jī)制也各有不同，但是主要可以分為兩種類(lèi)型：特異效應(yīng)作用機(jī)制與非特異效應(yīng)作用機(jī)制。特異性效應(yīng)一般發(fā)生在短雙鏈RNA（21～23nt）上，非特異性效應(yīng)發(fā)生于長(zhǎng)雙鏈RNA（30nt以上）。 RNAi的特點(diǎn)RNAi具有高效性，也就是說(shuō)與細(xì)胞內(nèi)的mRNA的量相比，注入細(xì)胞內(nèi)的siRNA的量要少得多。但由于循環(huán)放大機(jī)制的存在，仍可以有效地阻斷目的基因的表達(dá)；同時(shí)，RNAi也具有高特異性，小干擾RNA由dsRNA降解得到的，除在序列識(shí)別中不起主要作用的正義鏈3′端的兩個(gè)堿基以外，其余堿基均為必需。 siRNA簡(jiǎn)介RNA干擾作用是通過(guò)siRNA（small interfering RNA，siRNA）這類(lèi)小RNA分子作為較穩(wěn)定的中間介質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)對(duì)植物的研究證明，雙鏈RNA復(fù)合體降解為35nt左右的小RNA分子后通過(guò)序列互補(bǔ)與mRNA結(jié)合，進(jìn)而降解mRNA。 siRNA的設(shè)計(jì)原則RNAi 作用的成功與否，關(guān)鍵在于siRNA序列的結(jié)構(gòu)，不同結(jié)構(gòu)的siRNA序列沉默基因的效率差別很大，2001年，Elbashir S M等[應(yīng)用化學(xué)合成法合成了siRNA，并發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物發(fā)生RNAi，他們進(jìn)而據(jù)此提出了siRNA 設(shè)計(jì)方法：1)從起始密碼下游50~100nt開(kāi)始搜索siRNA以避免出現(xiàn)于5′或3′端的UTRs 的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，；2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果沒(méi)有相應(yīng)序列，可以選擇5′AA(N21)或5′N(xiāo)A(N21)；3)G/C含量在32%~79%之間[16]； 4)要確定siRNA對(duì)靶基因的特異性，可以利用Blast軟件在基因組中進(jìn)行比對(duì)，；5)設(shè)置在基因組中無(wú)對(duì)應(yīng)序列的siRNA的對(duì)照siRNA。但是，Elbashir S M等的設(shè)計(jì)方法siRNA 篩選效率仍然很低，要更好的掌握RNAi。 用于RNAi的載體基因工程中，攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具，稱(chēng)為載體。是指能夠運(yùn)載外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力，使外源DNA片段在受體細(xì)胞中得到擴(kuò)增和表達(dá)，不被受體細(xì)胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類(lèi)DNA分子