【文章內(nèi)容簡介】 Xgal， 菌落呈藍(lán)色 lacI P lacO CRP site 外源 DNA 片段 外源 DNA 片段破壞 lacZ’ 外源 DNA 片段 插入 MCS 質(zhì)粒 宿主細(xì)胞基因組 lacZ” P lacO CRP site ?半乳糖苷酶羧基端 lacI IPTG 誘導(dǎo) IPTG 誘導(dǎo) 無 ?半乳糖苷酶氨基端產(chǎn)生 無 ?半乳糖苷酶 活性 不水解 Xgal (白色菌落 ) . . . . . . . . . . . . 外源 DNA 片段 破壞 lacZ’ 轉(zhuǎn) 化 無 ?半乳糖苷酶氨基端 ?半乳糖苷酶羧基端 無 ?半乳糖苷酶活性 不水解 Xgal， 菌落呈 白色 ? 噬菌體 由 ? 噬菌體改造而成的載體，可容納 525 kb的 外源 DNA 片段， 常用于構(gòu)建基因組文庫或 cDNA 文庫 。 (1) 插入型載體 只有一個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)可供外源 DNA 插入的載體為插入 型載體?？稍诳寺∥稽c(diǎn)插入 511 kb 的 外源 DNA 片段。 (2) 置換型載體 在非必需 DNA 兩側(cè)有一對(duì)克隆位點(diǎn)的噬菌體載體稱 作置換型載體。中部的 DNA 由外源 DNA 片段 (825 kb) 所置換。 ? 噬菌體 載體 (? Phage vector) 外源 DNA 重組 DNA 分子 體外包裝 攜帶重組 DNA 分子的 ? 噬菌體 DNA 連接酶 限制性內(nèi)切酶 (1) 粘粒載體是 質(zhì)粒和 ? 噬菌體的重組體 ，將含有 cos 位 點(diǎn)的部分 ? DNA 插入到質(zhì)粒中即構(gòu)建成粘粒載體。 (2) 粘粒載體可容納 3545 kb 的外源 DNA 片段，用于構(gòu) 建基因組 DNA 文庫。 (3) 粘粒載體可經(jīng)體外包裝而形成感染顆粒，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)入 大腸桿菌，具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率。 粘粒 (Cosmid) (1) BAC是環(huán)狀 DNA 分子，包括 MCS 抗生素抗性基因、 復(fù)制子：來源于大腸桿菌 F 因子 RepE： 調(diào)節(jié)復(fù)制復(fù)合物在復(fù)制位點(diǎn) 處組裝 parAC 基因：確保子細(xì)胞含有單拷貝質(zhì)粒 ? cos 位點(diǎn)：用于 噬菌體外殼蛋白包裝 (2) BAC 可容納至 1 Mb 大小的外源 DNA 片段。用電穿孔 方法將 BAC 與外源 DNA 片段的連接物導(dǎo)入大腸桿菌 或經(jīng)噬菌體外殼蛋白包裝后轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌。 細(xì)菌人工染色體 (Bacterial artificial chromsome， BAC) 目的基因的表達(dá) (Expression of target genes) 功能分析 結(jié)構(gòu)分析 建立藥篩模型 臨床藥物 獲得目的基因或 cDNA 亞克隆到表達(dá)載體 表達(dá)目的蛋白 基因治療 表達(dá)載體 (Expression vectors) ? 用于表達(dá)某一基因或 cDNA以獲得目的蛋白質(zhì) ? 表達(dá)載體包括原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體 ? 根據(jù)要表達(dá)的目的蛋白質(zhì)的特點(diǎn)來選擇載體 復(fù)制起始點(diǎn) (Replication origin) 多克隆位點(diǎn) (Multiple cloning sites) 抗生素抗性基因 (Antibiotics resistance gene) 啟動(dòng)子 (promoter) 轉(zhuǎn)錄終止子 (transcription terminator) 加 PolyA 的信號(hào)序列 (真核表達(dá)載體 ) 核糖體結(jié)合位點(diǎn) (ribosome binding site, RBS) 表達(dá)載體 啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄終止子 抗生素 抗性基因 多克隆位點(diǎn) 復(fù)制起點(diǎn) 表達(dá)載體 （一） 原核表達(dá)載體 除具備克隆載體的一般特點(diǎn)外，還需有 調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列等。 原核表達(dá)載體 大腸桿菌表達(dá)載體 基本組成如下： R：調(diào)節(jié)序列； P：啟動(dòng)子； SD： SD序列； TT：轉(zhuǎn)錄終止序列 大腸桿菌表達(dá)載體 ?Lac啟動(dòng)子 （ 乳糖啟動(dòng)子 ） ?Trp啟動(dòng)子 （ 色氨酸啟動(dòng)子 ） ?Tac啟動(dòng)子 （ 乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子 ） ?PL和 PR啟動(dòng)子 （ λ噬菌體的左向和右向啟動(dòng)子 ） ?T7啟動(dòng)子 1. 啟動(dòng)子 表達(dá)必需元件，其能被 RNA聚合酶所識(shí)別： 目前原核表達(dá)載體常使用的啟動(dòng)子有以下幾種 2. SD序列 提供核糖體結(jié)合位點(diǎn) mRNA在細(xì)菌中的翻譯嚴(yán)格依賴于核糖體結(jié)合位點(diǎn) （ ribosome binding site） 的存在 。 SD序列作為核糖體結(jié)合位點(diǎn) ， 保證了翻譯起始復(fù)合物的形成 。 3. 轉(zhuǎn)錄終止序列有助于外源基因的高效表達(dá) 多數(shù)原核表達(dá)載體中都帶有轉(zhuǎn)錄終止序列 轉(zhuǎn)錄終止序列長短不一，幾十 bp幾百 bp 有助于使 RNA聚合酶重點(diǎn)轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因 4. 幾種常見的原核表達(dá)載體各有特點(diǎn) 依據(jù)表達(dá)目的蛋白的方式，可將原核表達(dá)載體分為 （ 1）非融合型表達(dá)載體 （ 2）融合型表達(dá)載體 （ 3）分泌型表達(dá)載體 （ 1）非融合型表達(dá)載體用于表達(dá)非融合蛋白 非融合蛋白是指不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起進(jìn)行表達(dá)的蛋白 。 表達(dá)該類蛋白的載體稱為非融合型表達(dá)載體 。 ?強(qiáng)啟動(dòng)子 tac ?多克隆位點(diǎn) ?目的基因克隆于啟動(dòng)子和 SD序列下游 ?rrnB核糖體 RNA轉(zhuǎn)錄終止子 ， 穩(wěn)定載體系統(tǒng) ， 不至于干擾與載體本身穩(wěn)定性有關(guān)的基因表達(dá) 。 ?載體的其余部分來自 pBR322。 ?使用 pKK2233時(shí) ， 應(yīng)配套使用LacIq宿主菌 ， 在無 IPTG誘導(dǎo)時(shí) ，tac啟動(dòng)子受阻遏 ， 當(dāng)加入 IPTG后 ，便可去阻遏 ， 從而使外源基因表達(dá) 。 ?將一段特殊蛋白質(zhì)基因構(gòu)建入載體 ， 使之與目的蛋白融合表達(dá)形成融合蛋白 （ fusion protein） 。 ?表達(dá)該類蛋白的載體稱為融合型表達(dá)載體 ， 如 pGEX系統(tǒng)（ pGEXlλT 、 pGEX2T 、pGEX3X 、 pGEX4T 、pGEX5X、 pGEX6P） 。 ?載體使用強(qiáng)啟動(dòng)子 tac， ?SD序列 ?下游 GST基因 ?多克隆位點(diǎn) ?用 IPTG可誘導(dǎo)目的基因表達(dá) ， 表達(dá)產(chǎn)物與 GST融合 ，故可利用該標(biāo)簽對(duì)蛋白進(jìn)行純化 。 （ 2）融合型表達(dá)載體用于表達(dá)融合蛋白 ?把受體細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的外源蛋白有效地分泌到周質(zhì)腔，甚至穿過細(xì)胞外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。 ?啟動(dòng)子、編碼信號(hào)肽的序列（通常置于 SD序列下游）。 ?非融合蛋白、融合蛋白表達(dá)。 ?pIN Ⅲ 系列載體 常用 ， 可使所表達(dá)的蛋白分泌到宿主菌的周質(zhì)腔中 。 （ 3）分泌型表達(dá)載體用于外源基因的分泌表達(dá) pIN Ⅲ 系列載體有 3種，即 pIN Ⅲ ompApIN Ⅲ ompA2和 pIN Ⅲ ompA3，分別適用于使用不同密碼子框架的目的基因的插入，克隆位點(diǎn)分別為 EcoRⅠ 、 HindⅢ 和 BamHⅠ 。 ? T7 啟動(dòng)子：與 T7 RNA 聚合酶特異結(jié)合 ? RBS： 目的蛋白質(zhì)翻譯時(shí) mRNA 與核糖體結(jié)合的位點(diǎn) ? 標(biāo)記：便于檢測和純化目的蛋白 (1) 組氨酸標(biāo)記 (HisTag ) 610個(gè) 組氨酸 與目的蛋白質(zhì)的 N 或 C 末端形成融合蛋 白，便于用組氨酸 Ni2+ 親和層析方法一次純化目的蛋 白質(zhì)。 Histag 是親水性物質(zhì)，不影響目的蛋白的三維 空間構(gòu)象的形成，因此， Histag 不影響目的蛋白質(zhì)的 生物活性。 (2) 其它標(biāo)記 T7Tag， STag， GSTTag， CBDTag 等 ? T7 轉(zhuǎn)錄中止子 原核表達(dá)載體 pET 表達(dá)系統(tǒng) （二） 真核表達(dá)載體 用于在真原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因 真核表達(dá)載體包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性基因、多克隆位點(diǎn)等。 真核表達(dá)載體中還具有： ① 真核表達(dá) 調(diào)控元件 ：包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、 poly A 加尾信號(hào)等 ② 真核細(xì)胞 復(fù)制起始序列 ③ 真核細(xì)胞 藥物抗性基因 OriPro：原核復(fù)制起始序列 P：啟動(dòng)子 MCS：多克隆位點(diǎn) TT：轉(zhuǎn)錄終止序列 orieuk：真核復(fù)制起始序列 注：不是所有真核表達(dá)載體都有整合序列 真核表達(dá)載體的基本組成 酵母表達(dá)載體 昆蟲表達(dá)載體 哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體 根據(jù)真核宿主細(xì)胞的不同，真核表達(dá)載體可主要分為 ： ? 用于基因治療的病毒表達(dá)載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 (Retroviral vectors) 腺病毒載體 (Adenoviral vectors) ? 用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)載體 含組織表達(dá)特異性的啟動(dòng)子 其它特殊表達(dá)載體 脂質(zhì)雙層 受體結(jié)合蛋白 逆轉(zhuǎn)錄酶 病毒 RNA 基因組 (2 個(gè)分子拷貝 ) 核心蛋白質(zhì) 病毒 RNA 基因組 逆轉(zhuǎn)錄病毒 (Retrovirus) 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 生 活 周 期 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 () 轉(zhuǎn)染 包裝細(xì)胞系 目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶 目的基因和選擇性標(biāo)記以及調(diào)節(jié)序列的 RNA 感染靶細(xì)胞 目的基因和選擇性標(biāo)記 以及調(diào)節(jié)序列的 RNA被 包裝成“病毒”顆粒 靶細(xì)胞 目的基因整合到靶細(xì)胞的 基因組DNA中 宿主細(xì)胞的選擇由所用的載體來決定，即細(xì)胞必須與載體匹配。 ? 大腸桿菌 BL21(DE3)， BL21(DE3)pLysS， BL21(DE3)pLysE 等 ? 酵母細(xì)胞 P. pastoris， S. Cerevisiae， S. pombe 和 P. methanolica ? 昆蟲細(xì)胞系 S2， Sf9， Sf21 ? 各種高等真核生物組織細(xì)胞 表達(dá)用宿主細(xì)胞 ? 大腸桿菌： 化學(xué)法和 電穿孔法轉(zhuǎn)化 ? 酵母細(xì)胞：電穿孔法轉(zhuǎn)化 ? 昆蟲細(xì)胞和哺乳類細(xì)胞：轉(zhuǎn)染和感染 (1) 轉(zhuǎn)染 CaPO4/DNA共沉淀法 DEAE葡聚糖方法 脂質(zhì)體法 電穿孔法 顯微注射法 (2) 感染 用攜帶目的基因的“病毒”顆粒感染宿主細(xì)胞 表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法 CaPO4DNA共沉淀法 鈣離子與 DNA的磷酸基團(tuán)結(jié)合形成不溶沉淀 CaPO4DNA， 并附著于細(xì)胞表面，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用被細(xì)胞所吸收。 DEAE葡聚糖方法 帶正電荷的 DEAE葡聚糖與帶負(fù)電荷的 DNA 磷酸基團(tuán)結(jié)合形成 DEAE葡聚糖 DNA 復(fù)合物并結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用被細(xì)胞所吸收。 脂質(zhì)體法 陽離子脂質(zhì)富集 DNA 分子，形成穩(wěn)定的 DNA脂質(zhì)體并附著于帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜發(fā)生融合， DNA 被細(xì)胞所吸收 。 電穿孔法 原理同 電穿孔 轉(zhuǎn)化方法，但所用的參數(shù)不同。 轉(zhuǎn)染方法 人工合成的陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu) 構(gòu)建攜帶目的基因的表達(dá)載體 表達(dá)載體被細(xì)胞吸收到細(xì)胞質(zhì)中 表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中 目的基因及選擇性標(biāo)記整合到 基因組 DNA中 目的基因在真核細(xì)胞中的表達(dá) 暫態(tài)表達(dá) 穩(wěn)定表達(dá) 轉(zhuǎn)染 暫態(tài)表達(dá) (Transient expression) 攜帶目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞后，表達(dá)載體以附加體 (episome) 形式存在于細(xì)胞核，目的基因不整合到宿主細(xì)胞的基因組 DNA中。通常目的基因的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞的影響在 2472 小時(shí)內(nèi)被檢測到 并隨著附加體的消失而最終消失。 穩(wěn)定表達(dá) (Stable expression) 攜帶目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞后，經(jīng)選擇培養(yǎng)基的篩選而獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，目的基因整合到細(xì)胞的基因組 DNA中并隨著 基因組 DNA 的復(fù)制而復(fù)制 。 穩(wěn)定細(xì)胞系可以持續(xù)表達(dá) 目的基因。 核糖體 細(xì)胞核 RNA 目的蛋白 染色體 1 2