【正文】 的過程 ? 變性 (Denaturing): 經(jīng)加熱使模板 DNA 從 dsDNA 變成 ssDNA ? 退火 (Annealing): 引物與模板 DNA雜交 ? 延伸 (Extension): DNA 合成 ing PCR的頭三個循環(huán) 基因組 DNA 的制備 (Preparation of genomic DNA) 從細(xì)胞或組織中提取的 基因組 DNA 可用于 : ? 建立基因組文庫； ? 克隆特定的基因； ? 用 Southern 印跡檢測某一基因的存在和拷貝數(shù)； ? 用 PCR 反應(yīng)檢測基因的存在和突變等； ? 進行 RFLP(限制性片段長度多態(tài)性 ) 分析 ? 蛋白酶 K 和 SDS 可 破壞細(xì)胞膜 及細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，使 基因組 DNA 從破碎的細(xì)胞中釋放出來。 第二步： 篩選含有目的基因 的克隆。轉(zhuǎn)化率為 5 X 1062 X 107 轉(zhuǎn)化子 /?g DNA。 感染 (Infection)： 利用病毒將外源 DNA 導(dǎo)入真核細(xì)胞的 過程。 核糖體 細(xì)胞核 RNA 目的蛋白 染色體 1 2 目的基因 選擇性標(biāo)記 1 暫態(tài)表達 2 穩(wěn)定表達 整合 宿主細(xì)胞的選擇由所用的載體來決定，即細(xì)胞必須 與載體匹配。 轉(zhuǎn)染方法 人工合成的陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu) 構(gòu)建攜帶目的基因的表達載體 表達載體被細(xì)胞吸收到細(xì)胞質(zhì)中 表達載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中 目的基因及選擇性標(biāo)記整合到 基因組 DNA中 目的基因在真核細(xì)胞中的表達 暫態(tài)表達 穩(wěn)定表達 轉(zhuǎn)染 暫態(tài)表達 (Transient expression) 攜帶目的基因的表達載體轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞后，表達載體以附加體 (episome) 形式存在于細(xì)胞核，目的基因不整合到宿主細(xì)胞的基因組 DNA中。 ? 大腸桿菌 BL21(DE3)， BL21(DE3)pLysS， BL21(DE3)pLysE 等 ? 酵母細(xì)胞 P. pastoris， S. Cerevisiae， S. pombe 和 P. methanolica ? 昆蟲細(xì)胞系 S2， Sf9， Sf21 ? 各種高等真核生物組織細(xì)胞 表達用宿主細(xì)胞 ? 大腸桿菌： 化學(xué)法和 電穿孔法轉(zhuǎn)化 ? 酵母細(xì)胞：電穿孔法轉(zhuǎn)化 ? 昆蟲細(xì)胞和哺乳類細(xì)胞：轉(zhuǎn)染和感染 (1) 轉(zhuǎn)染 CaPO4/DNA共沉淀法 DEAE葡聚糖方法 脂質(zhì)體法 電穿孔法 顯微注射法 (2) 感染 用攜帶目的基因的“病毒”顆粒感染宿主細(xì)胞 表達載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法 CaPO4DNA共沉淀法 鈣離子與 DNA的磷酸基團結(jié)合形成不溶沉淀 CaPO4DNA， 并附著于細(xì)胞表面，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用被細(xì)胞所吸收。 ? T7 啟動子：與 T7 RNA 聚合酶特異結(jié)合 ? RBS： 目的蛋白質(zhì)翻譯時 mRNA 與核糖體結(jié)合的位點 ? 標(biāo)記：便于檢測和純化目的蛋白 (1) 組氨酸標(biāo)記 (HisTag ) 610個 組氨酸 與目的蛋白質(zhì)的 N 或 C 末端形成融合蛋 白，便于用組氨酸 Ni2+ 親和層析方法一次純化目的蛋 白質(zhì)。 ?啟動子、編碼信號肽的序列（通常置于 SD序列下游）。 ?將一段特殊蛋白質(zhì)基因構(gòu)建入載體 ， 使之與目的蛋白融合表達形成融合蛋白 （ fusion protein） 。 表達該類蛋白的載體稱為非融合型表達載體 。 細(xì)菌人工染色體 (Bacterial artificial chromsome， BAC) 目的基因的表達 (Expression of target genes) 功能分析 結(jié)構(gòu)分析 建立藥篩模型 臨床藥物 獲得目的基因或 cDNA 亞克隆到表達載體 表達目的蛋白 基因治療 表達載體 (Expression vectors) ? 用于表達某一基因或 cDNA以獲得目的蛋白質(zhì) ? 表達載體包括原核表達載體和真核表達載體 ? 根據(jù)要表達的目的蛋白質(zhì)的特點來選擇載體 復(fù)制起始點 (Replication origin) 多克隆位點 (Multiple cloning sites) 抗生素抗性基因 (Antibiotics resistance gene) 啟動子 (promoter) 轉(zhuǎn)錄終止子 (transcription terminator) 加 PolyA 的信號序列 (真核表達載體 ) 核糖體結(jié)合位點 (ribosome binding site, RBS) 表達載體 啟動子 轉(zhuǎn)錄終止子 抗生素 抗性基因 多克隆位點 復(fù)制起點 表達載體 （一） 原核表達載體 除具備克隆載體的一般特點外，還需有 調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等。 (2) 粘粒載體可容納 3545 kb 的外源 DNA 片段，用于構(gòu) 建基因組 DNA 文庫?？稍诳寺∥稽c插入 511 kb 的 外源 DNA 片段。 ? 異丙基 ?D硫代半乳糖苷 (IPTG) 誘導(dǎo)質(zhì)粒上的 ?供體 片段和 宿主細(xì)胞的 ?受體 片段的表達， 兩者結(jié)合 后才有 ?半乳糖苷酶 活性， 使底物 5溴 4氯 3吲哚 ?D半乳糖 苷 (Xgal) 產(chǎn)生藍色 。L in C h ao et al. ( 1 99 2)p M OB 45 p K N 40 2 15 1 18 B it t n er amp。 質(zhì)粒載體所攜帶的復(fù)制子 質(zhì)粒 復(fù)制子 拷貝數(shù) 參考文獻p B R 32 2 p M B 1 15 2 0 B o li v er e t al. ( 19 7 0)pUC p M B 1 改進型 50 0 70 0 V ieir a amp。 高拷貝數(shù)質(zhì)粒： 10200個 /細(xì)胞 低拷貝數(shù)質(zhì)粒：幾個 /細(xì)胞 ? 質(zhì)粒還 含有在特定環(huán)境條件下所必需的基因 ， 如抗生素的 抗性基因。 克隆載體 宿主細(xì)胞 載體結(jié)構(gòu) 外源插入片段 質(zhì)粒 大腸桿菌 環(huán)狀質(zhì)粒 10 kb ? 噬菌體載體 大腸桿菌 線狀病毒 8 25 kb 粘粒 大腸桿菌 環(huán)狀質(zhì)粒 35 45 kb 細(xì)菌人工染色體 大腸桿菌 環(huán)狀質(zhì)粒 50 300 kb 酵母人工染色體 酵母 線狀染色體 100 1000 kb 不同 類型克隆載體 的比較 克隆載體 應(yīng)具備的主要 特點 ? 至少有一個 復(fù)制起點 （ origin of replication, ori） ? 至少有一個 選擇性標(biāo)志 （ selection marker） ? 有適宜的 限制性內(nèi)切酶的單一切點 ：稱為多克隆位點（ multiple cloning sites， MCS） ? 應(yīng)有 較高的拷貝數(shù) 。 依賴 DNA的 DNA聚合酶 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶無 3’ ?5’ 外切酶活性。羥基末端磷酸化 DNA 核酸酶 I (DNA nuclease I) S1 核酸酶 (S1 nuclease) 外切核酸酶 III (Exonuclease III) ? 外切核酸酶 (? Exonuclease) 2. 修飾酶 (Modifying enzymes) T4 DNA 連接酶 , ATP TGCTTAA 5’ 3’ ACG OH 3’ P 5’ AATTCGT GCA 3’ 5’ 5’ P 3’ OH TGCTTAA 5’ 3’ ACG AATTCGT GCA 3’ 5’ T4 DNA 連接酶 (T4 DNA ligase) 催化 DNA 的 3’OH 和 5’P 之間形成 磷酸二酯鍵 連接 帶 粘性末端 的兩個 DNA 分子 T4 DNA連接酶 , ATP ACG 5’ 3’ TGC OH 3’ P 5’ TAGCCGT ATCGGCA 3’ 5’ 5’ P 3’ OH 5’ 3’ TGCTAGCCGT ACGATCGGCA 3’ 5’ 連接 帶 平端 的兩個 DNA 分子 粘性末端 平端 DNA聚合酶 I Klenow片段 Klenow片段是 DNA 聚合酶 I 的羧基端片段，長度為全酶的 70％。這兩個相同的黏端稱為 配伍末端 (patible end)。 “ 內(nèi)切酶 ”是指 酶切位點 在 DNA 分子內(nèi)，而不是兩端。重新組合在一起 DNA片段稱作 重組 DNA 分子 。 細(xì)菌基因組 大腸桿菌： 4 x 106 bp 人類基因組： 3 x 109 bp ? 克隆 (Clone) 指用 無性繁殖 方法產(chǎn)生一組 遺傳上相同的細(xì)胞 和生物群 體過程。 T C A G G T G A T C T G G 539。 磷酸二酯鍵的形成 539。 堿基平面垂直螺 旋軸，相鄰堿基平面距離為 nm， 螺旋一圈包含 10 對堿基。 堿基互補配對形式： A ? T； G? C) 2. DNA 是右手螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋直徑為 2 nm， 螺距為 nm。 5 39。 539。 ? 基因組 (Genome) 一種生物全部染色體的遺傳物質(zhì)的總和，以全長 DNA 的堿基對 (bp) 數(shù)目表示。 ? DNA 重組技術(shù) (Rebinant DNA techniques) 利用 限制性內(nèi)切酶 、 連接酶 等在 體外 將 不同 生物體的 DNA 片段 進行 重新組合 的技術(shù)。這就構(gòu)成了細(xì)菌的 “ 限制 修飾系統(tǒng) ” 的分子基礎(chǔ)。 類型 II 限制性內(nèi)切酶 同一細(xì)菌株中不同的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和分離的順序，用羅馬字表示 屬名 (大寫 ) EcoRI 種名 (小寫 ) 細(xì)菌株名 (大寫 ) Escherichia 屬 coli 種 R株 識別序列 (1) 具 有 回文結(jié)構(gòu) BamHI 5’ G?GATCC 3’ 3’ CCTAG?G 5’ KpnI 5’ GGTAC?C 3’ 3’ C?CATGG 5’ (2) 具有 間斷的回文結(jié)構(gòu) HinfI (XmnI) 5’ G?ANTC 3’ 3’ CTNA?G 5’ (3) 具有 簡并性堿基 HincII 5’ GT(T/C)?(A/G)AC 3’ 3’ CA(A/G)?(T/C)TG 5’ (4) 無回文結(jié)構(gòu) MboII 5’ GAAGA(N)8? 3’ 3’ CTTCT(N)7? 5’ GAATTC CTTAAG CTTAA 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ G AATTC G 5’ P 3’ OH OH 3’ P 5’ CTGCAG GACGTC 5’ 3’ 3’ 5’ CTGCA 5’ 3’ G OH 3’ P 5’ ACGTC 5’ P 3’ OH G 3’ 5’ EcoRI PstI 經(jīng)限制性內(nèi)切酶 酶切 后所產(chǎn)生的 末端類型 (1) 粘性末端 (sticky ends, cohesive ends) 5’ 凸端 (5’ overhang) 粘性末端 3’ 凸端 (3’ overhang) 粘性末端 CCCGGG GGGCCC 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ OH 3’ P 5’ CCC GGG GGG CCC 5’ P 3’ OH 3’ 5’ SmaI 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ OH 3’