【正文】 + Br 溴化乙錠 (Ethidium bromide, EB) EB/ 堿基 瓊脂糖凝膠中 DNA 的檢測 EB 染色方法 EB 終濃度： ?g/ml (1) 將 EB 直接加入瓊脂糖凝膠中染色。 RNA 瓊脂糖凝膠電泳 1． 10X MOPS 電泳緩沖液 200 mM MOPS [3(嗎啉代 )丙磺酸 ], pH 50 mM NaAc 10 mM EDTA, pH 使用前，將 10X MOPS 稀釋至 1X MOPS 2． 甲醛 瓊脂糖凝膠的制備 甲醛的終濃度： ％ 3． 電泳前 RNA 樣品的處理 用 甲醛和甲酰胺等 處理 RNA 樣品以 打開的 RNA 發(fā) 夾結(jié)構(gòu) 4． 電泳結(jié)束后 用 EB 染色液染色。 并具有 5`3`聚合酶活性及 3`5`外切酶活性 ， 因此可以校正 PCR反應(yīng)中某些單核甘酸的錯配 。 Tm = + (%G + C) PCR產(chǎn)物的檢測 ? 瓊脂糖凝膠電泳； （ EB） ? 分子雜交； ? 限制性內(nèi)切酶酶切分析； ? 微孔板夾心雜交法； ? 直接測序 反轉(zhuǎn)錄 PCR (RTPCR) RTPCR 將以 RNA 為模板的 cDNA 合成同 PCR 結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。 (2) 遺傳病相關(guān)基因的檢測：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病。 ? 引物 5`末端 堿基無嚴(yán)格限制 ， 只要與模板 DNA結(jié)合的引物長度足夠 ， 末端 可以游離 。 PCR特異性 取決于人工合成的一對引物和模板 DNA結(jié)合的特異性 。 ? 為防止外源性 RNase 的污染，所用的托盤、梳子、 倒膠槽、電泳槽等需要用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或 H2O2處理；所用的緩沖液要用 DEPC 處理的 ddH2O 來配制。 DNA 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠濃度與線狀 DNA 分子的有效分離范圍 瓊脂糖凝膠濃度 (%) 線狀 DNA 分子的有效分離范圍 (kb) 30 → 12 → 10 → 7 → 3 → 常用電泳緩沖液 緩沖液 工作液 儲存液 /LT A E 1 X 5 0 X4 0 mM T r is 乙酸 2 4 2 g T ri s1 mM EDT A 5 7 .1 ml 冰乙酸1 0 0 m l 0 . 5 M EDT A (p H )TBE 0 .5 X 1 0 X4 5 mM T r is 硼酸 1 0 8 g T ri s1 mM EDT A 5 5 g 硼酸4 0 ml 0 .5 M EDT A ( pH 8 .0 )TPE 1 X 1 0 X9 0 mM T r is 磷酸 1 0 8 g T ri s2 mM EDT A 1 5 .5 ml 磷酸4 0 ml 0 .5 M EDT A ( pH 8 .0 )6X 樣品緩沖液 ％ 溴酚藍(lán) ％ 二甲苯氰 FF 40％ 蔗糖 (1) 溴酚藍(lán)和二甲苯氰 FF 在電場中向正極移動，用來預(yù)測 DNA 樣品的電泳情況。Cl, pH 。 TrisHCl 飽和酚：用 TrisHCl (pH ) 來 飽和酚 , 使 其 pH 值達(dá)到 ；否則呈酸性的酚將導(dǎo)致 DNA 分子 損傷斷裂。 用 TRIzol 試劑處理細(xì)胞或勻漿組織 氯仿萃取蛋白質(zhì) 沉淀 RNA 洗滌 RNA 沉淀 用 RNasefree ddH2O 溶解 RNA， 并置 20?C保存 檢測 RNA (加５ ?l RNA到１ % 瓊脂糖凝膠中 ) 總 RNA提取過程 rRNA 80% 哺乳動物細(xì)胞的總 RNA tRNA 和 snRNA 10% mRNA 13% M． RNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (RNA ladder) 1, 2． 人肝細(xì)胞總 RNA 28S rRNA (5025 bp) 18S rRNA (1868 bp) 28S rRNA 條帶強(qiáng)度是 18S rRNA 條帶強(qiáng)度的 2 倍。 ? 異硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸鈉為 強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變 性劑 ，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，使 總 RNA 從細(xì)胞中釋放出來 。 基因組 DNA的制備方法 (1) 防止內(nèi)源性 DNase 應(yīng)快速分離、剪切、勻降組織或快速洗滌培養(yǎng)細(xì)胞。 ? 鹽離子存在時 乙醇或異丙醇 沉淀基因組 DNA以 濃縮 DNA。 轉(zhuǎn)化率為 109 轉(zhuǎn)化子 /?g DNA。 轉(zhuǎn)染 (Transfection)： 將外源 DNA 導(dǎo)入 真核細(xì)胞 的過程。 脂質(zhì)體法 陽離子脂質(zhì)富集 DNA 分子，形成穩(wěn)定的 DNA脂質(zhì)體并附著于帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜發(fā)生融合， DNA 被細(xì)胞所吸收 。 ?pIN Ⅲ 系列載體 常用 ， 可使所表達(dá)的蛋白分泌到宿主菌的周質(zhì)腔中 。 ?載體的其余部分來自 pBR322。 粘粒 (Cosmid) (1) BAC是環(huán)狀 DNA 分子，包括 MCS 抗生素抗性基因、 復(fù)制子：來源于大腸桿菌 F 因子 RepE： 調(diào)節(jié)復(fù)制復(fù)合物在復(fù)制位點 處組裝 parAC 基因：確保子細(xì)胞含有單拷貝質(zhì)粒 ? cos 位點：用于 噬菌體外殼蛋白包裝 (2) BAC 可容納至 1 Mb 大小的外源 DNA 片段。 ?互補(bǔ) (?plementation) lacI P lacO CRP site MCS lacZ” P lacO CRP site 質(zhì)粒 lacZ’ 宿主細(xì)胞基因組 無外源 DNA 片段 插入 MCS ?半乳糖苷酶 氨基端 (?供體片段 ) IPTG 誘導(dǎo) ?半乳糖苷酶 羧基端 (?受體片段 ) 水解 Xgal (藍(lán)色菌落 ) ?互補(bǔ) lacI IPTG 誘導(dǎo) ?供體 片段 ?受體 片段 ?半乳糖苷酶 活性 Xgal . . . . . . . . . . . . . 轉(zhuǎn) 化 ?半乳糖苷酶氨基端 ?半乳糖苷酶氨基端 ?半乳糖苷酶羧基端 ?半乳糖苷酶 ?半乳糖苷酶 水解 Xgal， 菌落呈藍(lán)色 lacI P lacO CRP site 外源 DNA 片段 外源 DNA 片段破壞 lacZ’ 外源 DNA 片段 插入 MCS 質(zhì)粒 宿主細(xì)胞基因組 lacZ” P lacO CRP site ?半乳糖苷酶羧基端 lacI IPTG 誘導(dǎo) IPTG 誘導(dǎo) 無 ?半乳糖苷酶氨基端產(chǎn)生 無 ?半乳糖苷酶 活性 不水解 Xgal (白色菌落 ) . . . . . . . . . . . . 外源 DNA 片段 破壞 lacZ’ 轉(zhuǎn) 化 無 ?半乳糖苷酶氨基端 ?半乳糖苷酶羧基端 無 ?半乳糖苷酶活性 不水解 Xgal， 菌落呈 白色 ? 噬菌體 由 ? 噬菌體改造而成的載體，可容納 525 kb的 外源 DNA 片段， 常用于構(gòu)建基因組文庫或 cDNA 文庫 。19 8 7)。 ? 質(zhì)粒是 雙鏈、共價閉合的環(huán)狀 DNA 分子 ，以超螺旋形式 存在。 蛋白酶酶切位點 Klenow 片段 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ EcoRI 5’ G 3’ 5’ AATTC 3’ 3’ CTTAA 5’ 3’ G 5’ Klenow, dNTPs 5’ GAATT 3’ 5’ AATTC 3’ 3’ CTTAA 5’ 3’ TTAAG 5’ 5’ ?3’ 聚合酶活性 ： 補(bǔ)平 限制性內(nèi)切酶酶切所產(chǎn)生的 3’ 凹端而形成平端 5’ GGTACC 3’ 3’ CCATGG 5’ KpnI 5’ GGTAC 3’ 5’ C 3’ 3’ C 5’ 3’ CATGG 5’ Klenow 5’ G 3’ 5’ C 3’ 3’ C 5’ 3’ G 5’ 3’ ?5’ 外切酶活性 ： 去除 限制性內(nèi)切酶酶切所產(chǎn)生的3’凸端而形成平端 逆轉(zhuǎn)錄酶 (Reverse transcriptase， RT) ? 逆轉(zhuǎn)錄酶為 依賴 RNA的 DNA聚合酶 ，具有 5’ ?3’ 聚合酶活性外，以 RNA為模板合成 DNA。 5’ GGATCC 3’ 5’ GGA TCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ 3’ CCT AGG 5’ 5’ AGATCT 3’ 3’ TCTAGA 5’ 5’ CCCGGG 3’ 3’ GGGCCC 5’ 命名 屬名 (genus ) 的第一個字母，用大寫表示 種名 (species ) 的前兩個字母，用小寫表示 細(xì)菌株名 (strain)， 用大寫或小寫表示 同一細(xì)菌株中不同的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和分離的順序，用羅馬字表示。 ? 分子克隆 (Molecular cloning) 利用 DNA 重組技術(shù) 可使 一個基因或 DNA 片段 產(chǎn)生出 許多 相同的拷貝。 A G T C A T C A G A C C C 339。2 nm 大溝 ( nm) 小溝 ( nm) nm DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)要點 (Watson 和 Crick， 1953) 1. DNA 由兩條反相平行的脫氧核苷酸鏈 組成，脫氧核糖 磷酸骨架位于雙鏈的 外側(cè)，堿基位于內(nèi)側(cè)，雙鏈的堿基之 間以氫鍵相結(jié)合。 339。這些細(xì)胞或個體均來自無性繁殖單一原形細(xì)胞。 限制性內(nèi)切酶 (Restriction endonucleases) 類型 A TP 組成 識別序列 酶切位點 甲基化酶活性I 需要 由三種亞基組成的復(fù)合物兩側(cè)不對稱序列在離識別序列至少 1000 個堿基處酶切 DNA有II 不需要 單鏈多肽 為 4 6 個堿基，常具有回文結(jié)構(gòu)酶切位點在識別序列之中或其相鄰位置無III 需要 由二種亞基組成的復(fù)合物兩側(cè)不對稱序列在離識別序列 3 ’端的 2 4 2 6 個堿基處酶切 DNA有限制性內(nèi)切酶的 分類 回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 是雙鏈 DNA 分子中的反向重復(fù) 結(jié)構(gòu)，即每條鏈從 5’? 3’ 方向讀其核苷酸序列都相同。 具有 5’ ?3’ 聚合酶活性 及 3’ ?5’ 外切酶活性。 pBR322質(zhì)粒圖譜 ? 質(zhì)粒是 存在于細(xì)菌染色體 (基因組 ) 外的 DNA 分子 ，其 大小在 1 kb 200 kb 范圍內(nèi)。 M es s in g ( 19 8 2 。 兩個無活性片段組合而成為功能完整的 ?半乳糖苷酶的過程稱為 ?互補(bǔ)。 (3