【文章內(nèi)容簡介】 roninducible gene, Ifi202, in the susceptibility to systemic , 2001, 15(3):435443 [31] Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, et molecular profiles of highgrade and lowgrade gliomas based on oligonucleotide microarray Res, 2001, 61(18):68856891 [32] Neil J, use of realtime PCR methods in DNA sequence ariation Chimica Acta, 2006, 363:3247第二篇：《分子生物學(xué)與基因工程》課程論文植物基因工程研究進展摘要：自1983年美國人首先成功地獲得抗卡那霉素的煙草再生植株開始，人類就開始了植物基因工程的研究。至今已在逾200種植物中成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株,并有近1000例轉(zhuǎn)基因植物獲準進行田間試驗,更有十余種轉(zhuǎn)基因植物()。植物基因工程的應(yīng)用已進入蓬勃發(fā)展階段。下面是我從植物基因工程改善生物質(zhì)能利用的研究進展做一說明。關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素 細胞壁 水解酶近幾年來全世界對能源的需求量急劇增加加速了對有限的不可再生礦物質(zhì) 能源的消耗資源的利用也增加了CO2及粉塵的排放,造成環(huán)境破壞和全球氣候變 化[1]可再生的清潔的生物質(zhì)能成為人們關(guān)注的熱點。其中的燃料乙醇工業(yè),近年來在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的發(fā)展,我國也大力支持發(fā)酵乙醇用作能源[2]。目前,絕大部分乙醇來源于玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)。但是由于淀粉本身又作為食品和飼料,產(chǎn)量有限,成本較高,阻礙了乙醇工業(yè)的發(fā)展。于是,人們把注意力轉(zhuǎn)移到谷物秸稈等廉價 的含有大量 的木質(zhì) 纖維素 的生物質(zhì) 材料上希望 能夠被 充分利用 [3]。但由于木質(zhì)纖維素本身難以分解,許多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生產(chǎn)生的多糖資源更利于降解,用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇。在中國,大約每年會產(chǎn)生10t億農(nóng)林業(yè)廢棄物這些資源用于造紙、紡織或者直接作為燃料這些占到很少一部分。絕大部分被廢棄了木質(zhì)纖維素是光合作用的基本產(chǎn)物 , 也是生物圈產(chǎn)生的最充足的可再 生生物資源被認為是地球上最豐富的生物高分子聚合[4]。大部分的高等植物細胞壁由膠聯(lián)多糖、糖蛋白和木質(zhì)素組成雙 子 葉植物 , 如擬南芥等,細胞壁多糖主要有三種:纖維素半、纖維素和果膠質(zhì),包埋在非 纖 維多糖基質(zhì)(半纖維素和果膠)中的纖維素網(wǎng)絡(luò),與木質(zhì)素和結(jié)構(gòu)蛋白共同構(gòu)成植物細胞壁的聚合液晶結(jié)構(gòu)[5]天然狀態(tài)下由于木質(zhì)素的保護作用,阻礙了水解 纖維素酶與纖維素的接觸并發(fā)揮作用,成為影響纖維素水解的重要因素 [3, 4]。YangB等人發(fā)酵降解實驗證明,雖然半纖維素對纖維素。也有一定保護作用 , 但木質(zhì)素的去除對于纖維素有效降解是最關(guān)鍵的[6]。一般對木質(zhì)纖維素材料 的利用,首先要進行粉碎,然后預(yù)處理(酸堿處理等),最后 添 加 微 生物 來源 的纖維素復(fù)合水解酶類,使之與處理過的木質(zhì)纖維充分接觸,將其降解為單糖 , 從而用于乙醇發(fā)酵。現(xiàn)在雖然前期的粉碎和預(yù)處理工藝研究取得了很大進展但成本仍然較高，而且后期發(fā)酵分解處理。要添加來源于微生物的纖維素水解復(fù)合酶,價格仍十分昂貴[7]。這些因素導(dǎo)致目前用木質(zhì)纖維素作為這些因素 導(dǎo)致 目前用木質(zhì)纖維素作為原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇,成本較高發(fā)展緩慢因此,現(xiàn)在對木質(zhì)纖維素進行高效降解使用,仍然是個很大的難題。近年來隨著生物技術(shù)的不斷進步,人們開始嘗試利用植物基因工程方法來 解決植物木質(zhì)纖維素有效利用問題研究主要集中在改善植物細胞壁木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)和含量比例等方面,使植物多糖資源利于降解使用，或者利用植物作為生物反應(yīng)器,在植物內(nèi)表達微生物來源的強活性纖維素降解酶,使植物自身表達高活性纖維素水解 酶類等研究。 改善植物細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成過去幾十年的研究,改善木質(zhì)素含量及細胞壁已成為可能。利用基 因工程方法,控制植物內(nèi)木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達,可以改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和含量木質(zhì)素對纖維素形成的保護作用是導(dǎo)致 纖維素資源利用 的主要障礙,降低木質(zhì)素含量或改變其結(jié)構(gòu),將利于纖維素 的分解[8]。雖然植物體木質(zhì)素的合成過程還不是十分清楚,但近幾年的研究,已使大量降低木質(zhì)素含量成為可能。在玉米和苜蓿的研究中發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素合成單體之一的芥子醇, 其前體的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5hydroxyferulate Omethyltransferase),如果被抑制表達,芥子單體含量會明顯減少,可導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低 [9, 10]但是在楊樹中抑制這種酶的表達卻不能夠改善材質(zhì),木質(zhì)素含量反而增加[11]。Li L等人在楊樹中研究發(fā)現(xiàn),通過反義表達4CL基因(4coumarateCoA ligase)時,木質(zhì)素含量了減少了約40%,并且導(dǎo)致10%的纖維素含量的增加，如果正義表達控制木質(zhì)素組成單體紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈瘡木基丙烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因(Coniferaldehyde 5hydroxylase),可導(dǎo)致紫丁香基丙烷的量明顯增 高,但木質(zhì)素含量沒有變化[12]。當(dāng)兩基因同時轉(zhuǎn)化時,木質(zhì)素含量減少可達53%,紫丁香基丙烷含量進一步增加,而纖維素含量能夠增加30%。CanoDelgado A等人研究擬南芥CESA3突變體發(fā)現(xiàn),纖維素合成酶受損時,導(dǎo)致了木質(zhì)素大量合成[13]這表明在植物木質(zhì)部細胞中可能存在一種調(diào)控機制,當(dāng)木質(zhì)素含量減少時,為了維持支撐作用,纖維素含量會相應(yīng)增加。Chabannes M等人在煙草中研究發(fā)現(xiàn),同時抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 CAD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表達,可大量減少木質(zhì)素含量,但非預(yù)期 的還引起了細胞壁多糖酚類物質(zhì)及可溶性酚類物質(zhì)含量的變化[14]等人在番茄中抑制表達木質(zhì)素合成相關(guān)的CCR基因,導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低,同時與木質(zhì)素形成具有共同前體的酚類復(fù)合物增加[15]。Boudet AM等人通過抑制楊樹木質(zhì)素合成酶基因CCR,可導(dǎo)致植物細胞壁纖維 素成分更容易被纖維素分解菌Clostridium產(chǎn)糖量達到原來的2倍[16]這表明,降低木質(zhì)素等物質(zhì)含量后,非常利于纖維資源的利用。Li Y等人研究發(fā)現(xiàn),過氧化酶影響了木質(zhì)化過程[17]。Blee KA等人在煙草中反義抑制過氧化酶FBP1(French bean cationic peroxidase)同系物表達,在不影響植物生長發(fā)育的情況下,使木質(zhì)素含量降低了40%~50% [18]。通過基因工程方法,改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)與含量的方法改善植物細胞壁結(jié)構(gòu),利于作為能源植物,具有重要的研究價值。 植物體內(nèi)表達木質(zhì)纖維素水解酶過去幾十年的發(fā)展,植物已成功的作為重組蛋白表達的生物反應(yīng)器,它相對于微生物和動物表達的優(yōu)勢是具有較低的成本已在多種植物里面進行了異源重組蛋白的表達研究(如疫苗和工業(yè)用酶等),蛋白表達量高且保持了很好的生物學(xué)活性[19]。近幾年,人們開始在植物體內(nèi)進行微生物來源的研究,希望這些植物作為生物反應(yīng)器,大量表達并在細胞內(nèi)積累纖維素酶。收獲的植物,經(jīng)過粉碎和預(yù)處理(酸堿處理等)后,在分解過程中能利用自身表達的酶,不添加加來源于微生物的酶,就可以將纖維素充分分解為單糖, 進一步用于生產(chǎn)乙醇,降低生產(chǎn)成本(Sticklen M,2006)[20]。考慮到細胞質(zhì)表達對植物生長影響較大,一般采用定向胞外或細胞器積累表達（如定向質(zhì)外體葉綠體溶酶體等）Ziegler MT等人在擬南芥中,定向質(zhì)外體,積累表達了來源于Acidothermus cellulolyticus的耐熱內(nèi)切β1,4葡聚糖酶(Endo1,4βglucanase),表達量約達到葉子總可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性[21]，同樣是在擬南芥中,Hyunjong B等人定向葉綠體和過氧化酶體,積累表達來源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),%,明顯 高于細胞質(zhì)表達和單一細胞器定向表達[22]在煙草中Dai Z等人定向葉綠體, 的耐熱內(nèi)切β1,4葡聚糖酶,%[23]。Dai Z等人采用同樣的酶,比較了定向不同細胞器積累表達的差異,發(fā)現(xiàn)定向質(zhì)外體表達蛋 白量最高,且保持了較好的活性[24]。在其它的植物中,也進行了相關(guān)的研究, Xue GP等人在大麥的胚乳中,特異表達來源于Neocallimastix patriciarum 的內(nèi)切β1,4葡聚糖酶,%[25]。Oraby H 等人在水稻中,4葡聚糖酶,達到了葉子總可溶性蛋白的 %。目前的研究集中于將植物作為生物反應(yīng)器,盡可能多的表達并積累纖維素酶,用于后期的處理。在發(fā)酵分解過程可以利用植物自身表達的異源纖維素水解酶,節(jié)省了額外添加酶的量。表達 的大都是內(nèi)切β1,4葡聚糖酶或木聚糖酶,為了預(yù)處理后還 能保持較好活性,多采用穩(wěn)定性強的耐高溫酶。由于纖維素有效降解需要復(fù)合水解酶,并且木質(zhì)素對其具有很強的保護作用,這些植物不會發(fā)生自身降解。利用不斷發(fā)展的植物基因工程技術(shù),在能源植物研究方面已經(jīng)取得了不錯的研究進展。但是,目前要實現(xiàn)廉價充分的利用纖維資源,還有一定的困難。通過對植物細胞壁合成 代謝研究的不斷深入,應(yīng)該能夠獲得對自身生長發(fā)育不影響的低木質(zhì)素植物細胞壁木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及含量改善纖維素含量增加,利于降解發(fā)酵產(chǎn)乙醇。還希望最終能夠獲得一種能源植物,這種植物通過自身表達異源的高活性木質(zhì)纖維水解復(fù)合酶,酶的表達受到誘導(dǎo)調(diào)控,收獲前誘導(dǎo)表達,收獲后送往生物能源發(fā)酵工廠。這期間,木質(zhì)纖維素多糖在植物體內(nèi)也可進行持續(xù)降解,在發(fā)酵工廠只需添加一些簡單的輔助分解酶就可以徹底降解掉,使木質(zhì)纖維資源產(chǎn)乙醇變得十分簡單 參 考 文 獻: JP, Franssen HT, Simbeck Policy, 2006, 34 : 1984~ B, Lu Chem Technol Biotechnol, 2007, 82 : 6~ ME, et , 2007, 315 : 804~ SY, Himmel Agric Food Chem, 2006, 54(3): 597~ Rev Mol Cell Biol 2005 6 11 850~ B Wyman Bioeng 2004 86 1 88~ MA, et Bioeng, 2005, 93 : 56~ AJ, et , 2006, 311 :484~ J et Physiol 2002 130 4 1675~ D et Res 2001 10 5 457~ G et Biotechnol 2002 20 6 607~ L et Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4939~ Delgado A, et J, 2003, 34(3): 351~ M et J 2001 28 3 257~ der Rest B et Exp Bot 2006 57 6 1399~ AM Kajita S Grima Pettenati J et Plant Sci2003 8 12 576~ Y et Plant Res 2003 116 3 175~ KA, et , 2003, 64(1): 163~ Biotechnol J 2007 5 1 2~ Opin Biotechnol 2006 17 3 315~ MT, Thomas SR, Danna Breed, 2000, 6 : 37~ B, Lee DS, Hwang Exp Bot, 2006, 57 : 161~ Z, Hooker BS, Anderson DB, et Res, 2000, 9(1):43~ Z, et Res, 2005, 14(5): 627~ GP et Cell Rep 2003 21 11 1088~1094.第三篇：基因工程論文基因工程論文一． 定義基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段二，基本操作步驟：1．提取目的基因：一條是從供體，的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因（1）直接分離基因：最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分別在各個受體細胞中大量復(fù)制（在遺傳學(xué)中叫做擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。（2）工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對的原則，推測出它的基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。：將目的基因與運載體結(jié)合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。：目的基因的片段與運載體在生物體外連接形成重組DNA分子后，下一步是將重組DNA分子引入受體細胞中進行擴增。：在全部的受體細胞中，真正能夠攝入重組DNA分子的受體細胞是很少的。必須通過一定的手段對受體細胞中是否導(dǎo)入了目的基因進行檢測。重組DNA分子進入受體細胞后，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因