高效液相色譜儀檢測食肉中瘦肉精含量(編輯修改稿)
2024-11-09 23:54 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 法，并對未來的發(fā)展方向作了展望。關(guān)鍵詞：瘦肉精 GCMS HPLC ELISA 引言瘦肉精是一類藥物，而不是某一種特定的藥物，任何能夠促進(jìn)瘦肉生長、抑制肥肉生長的物質(zhì)都可以叫做“瘦肉精”。在中國，通常所說的瘦肉精是指克倫特羅(Clenbuterol，CLB)【1】，而普通消費(fèi)者則把此類藥物統(tǒng)稱為瘦肉精。當(dāng)它們以超過治療劑量5—10倍的用量用于家畜飼養(yǎng)時，即有顯著的營養(yǎng)“再分配效應(yīng)”——促進(jìn)動物體蛋白質(zhì)沉積、促進(jìn)脂肪分解抑制脂肪沉積，能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率，因此，β—受體激動劑被大量非法用于畜牧生產(chǎn)，其中最常用的有克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等。長期食用含有β—受體激動劑殘留的食品將對人體健康產(chǎn)生極大的危害，可誘發(fā)和加重心率失常病人的病情，引起心室早搏，四肢、臉、頸部骨骼肌震顫；另外還能引起代謝紊亂，對糖尿病人可發(fā)生酸中毒或酮中毒【2】。鹽酸克倫特羅(Clenbuteerol，CLB)，又名克喘素、氨哮素、雙氯醇胺，俗名瘦肉精，化學(xué)名為α—[(叔丁氨基)甲基]—4—氨基—3，5—二氯苯甲醇鹽酸鹽，分子式為C12 H18Cl12N2O?HCl。目前，檢測瘦肉精殘留常用的色譜技術(shù)有高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(GC—MS)、高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC—MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)等。中國已將高效液相色譜法（HPLC）作為檢測飼料中鹽酸克倫特羅殘留的半確證法，將GC—MS 法定為確證性方法，主要用于最后確認(rèn)和仲裁。對于動物性食品，GB/T —2003 “動物性食品中克倫特羅殘留量的測定”規(guī)定的第一法為氣相色譜—質(zhì)譜法，第二法為高效液相色譜法，第三法為酶聯(lián)免疫法。下面將會對這三種方法逐一進(jìn)行說明，并簡單介紹毛細(xì)管電泳法（CE）【3】。2 動物性食品（豬肉）中鹽酸克倫特羅的檢測方法 氣相色譜—質(zhì)譜法(GC—MS)GC—MS法優(yōu)點(diǎn)是把色譜高效快速的分離效果和質(zhì)譜高靈敏度的定性分析有機(jī)結(jié)合起來，能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析，而且具更高的檢測極限。GC—MS法與HPLC法相比，檢測靈敏度更高，假陽性率更低【4】。下面將以島津公司采用的GC—MS法檢測瘦肉精為例，對儀器與試劑的選擇、樣品的處理方法等方面進(jìn)行介紹。儀器：島津GCMS—QP2010 Plus；試劑：鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CLB）標(biāo)準(zhǔn)品，內(nèi)標(biāo)（Clenbuterol—D9，CLB—D9），N，O—雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA），C18固相萃取小柱（100 mg，3 mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取鹽酸克倫特羅和內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放置于4℃冰箱中避光保存，使用時用甲醇稀釋成1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液和內(nèi)標(biāo)使用液。 分析條件色譜柱：Rtx—5MS(30 m mm μm)進(jìn)樣口溫度：220℃ 柱溫程序：70℃( min)—25℃/min—220℃(6 min)—25℃/min—280℃(5 min)恒線速度方式， mL/min 不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣時間1 min 接口溫度：280 ℃ 離子源溫度：200 ℃ 溶劑切割時間：8 min 檢測離子：CLB：檢測 m/z 86，187，243，262，CLB—D9：檢測 m/z 95，187，262 以克倫特羅(m/z86)與內(nèi)標(biāo)峰(m/z 95)的峰面積比校準(zhǔn)定量。 樣品制備精密稱取(2 177。 )g 己絞碎的豬肉于具塞離心管中，加入4 mL mol/L 鹽酸溶液，旋渦振蕩5 min，超聲10 min，12000 r/min 離心5 min后，傾出上清液， mol/L 鹽酸4 mL，2 mL 兩次提取，提取方法同上，合并上清液。將上清液全部上樣至C18 柱，用5 mL 水清洗小柱后， mL 甲醇：20 mmol/L 磷酸溶液=1：1(v/v)的酸化甲醇解析，加磷酸緩沖液調(diào)至pH=7，定容至2 mL。 mL/min的流速推過聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）毛細(xì)管整體柱萃取后， mL 的甲醇解析，加50 μL 的內(nèi)標(biāo)使用液后以氮吹儀濃縮至干。加入100 μL 甲苯和100 μLBSTFA，渦旋混勻30 s，置于微波爐中小火衍生5 min。衍生反應(yīng)完成后取出冷卻至室溫后再加入300 μL 甲苯，充分混勻，待氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣。 結(jié)論該法在樣品提取后，用C18 小柱和聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）整體柱進(jìn)一步富集凈化，經(jīng)N，O—雙三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)衍生，選擇離子監(jiān)測方式進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜測定。該方法具有檢測限低、重現(xiàn)性好、回收率高、樣品用量少等特點(diǎn)，適合于豬肉樣品中鹽酸克倫特羅的定性、定量測定。但GC—MS的缺點(diǎn)是檢測過程煩瑣、檢測時間長、需貴重儀器、難于操作、價格昂貴。 高效液相色譜法(HPLC)【5】HPLC適合測定熱不穩(wěn)定和強(qiáng)極性的β—激動劑及其代謝產(chǎn)物，而且HPLC可以與柱前提取、純化及柱后熒光衍生化反應(yīng)和質(zhì)譜(MS)等系統(tǒng)聯(lián)用，容易實(shí)現(xiàn)分析過程的自動化。HPLC 法【6】中常用的檢測器有電化學(xué)檢測器、紫外檢測器。 材料與儀器甲醇：色譜純；試驗(yàn)用水：均為超純水； 其余試劑：均為分析純；鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液： mg置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配成含鹽酸克倫特羅1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，貯于冰箱中，不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液由標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋而得；Dionex AT330(美國)高效液相色譜儀：由P680四元泵、UVD170U紫外檢測器和AT330恒溫箱組成；超聲波提取器(SB25200BTD)； 離心機(jī)(6 000 r/min)；DSY22型電熱恒溫水浴鍋。 色譜條件色譜柱采用Diamonsil ODS2C18 柱(5 μm，150 mm mm )；檢測波長為244 nm； 流動相甲醇∶水=26 ∶74； mL /min； 柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20μL。 樣品制備取10 g絞碎肉試樣， mol/L高氯酸20 mL 勻漿
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