【文章內(nèi)容簡介】 āo) ╳ 骨髓瘤細(xì)胞 ╳ 雜交瘤細(xì)胞 √ (2) 原理 HGPRT酶與TK酶： 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶 胸腺嘧啶核苷激酶,第五十頁，共一百二十三頁。,HAT培養(yǎng)基： H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成(h233。ch233。ng)主要途徑 T (Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNA,第五十一頁，共一百二十三頁。,核酸(h233。 suān)合成途徑 HGPRT H 主要合成途徑 糖、氨基酸 DNA A阻斷 T TK,第五十二頁，共一百二十三頁。,PEG 脾細(xì)胞(x236。bāo) 骨髓瘤細(xì)胞(x236。bāo) Ig+、HGPRT+、TK+ Ig、HGPRT、TK+ 雜交瘤細(xì)胞 Ig+、HGPRT+、TK+ HAT 7天死亡 HAT 死亡 存活,第五十三頁，共一百二十三頁。,(3)方法(fāngfǎ) A. 換液：23天換一次（半量換液） 7天內(nèi)：HAT 714天：HT 14天后：完全培基 B. 觀察,第五十四頁，共一百二十三頁。,脾細(xì)胞 SP2/0 飼養(yǎng)細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 0天 良好 良好 良好 可見融合細(xì)胞 12天 開始死亡 銳減 良好 成23個(gè)亮細(xì)胞 34天 大部死亡 幾乎(jīhū)完全死亡 良好 成簇35, 10個(gè)細(xì)胞 57天 死亡 死亡 變性 100177。 細(xì)胞成小島 714天 —— —— —— 1/31/5孔底,第五十五頁，共一百二十三頁。,6.雜交瘤細(xì)胞(x236。bāo)的篩選,(1)選擇篩選方法的原則 A. 快速(ku224。i s249。)簡便 B. 敏感性高 C. 特異性好 D. 方法穩(wěn)定 (2)步驟 A.篩出能分泌與預(yù)定抗原起反應(yīng)的單抗 的雜交瘤細(xì)胞 B.篩出有預(yù)定特異性的雜交瘤細(xì)胞 C.篩出可供實(shí)際應(yīng)用，具有穩(wěn)定生長和 功能特性的均一后代的克隆,第五十六頁，共一百二十三頁。,(3)方法(fāngfǎ) 常用的方法：固相放射免疫測定 固相酶免疫測定 免疫熒光技術(shù) 間接血凝試驗(yàn) 微量細(xì)胞毒試驗(yàn) 斑點(diǎn)試驗(yàn),第五十七頁，共一百二十三頁。,ELISA,第五十八頁，共一百二十三頁。,。,免疫熒光法,第五十九頁，共一百二十三頁。,7.克隆(k232。 l243。nɡ)化,(1)目的 選育出穩(wěn)定而同源的細(xì)胞系，淘汰遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞。 (2)方法 有限稀釋法 顯微(xiǎn wēi)操作法 軟瓊脂平板法 細(xì)胞選分儀法,第六十頁，共一百二十三頁。,有限(yǒuxi224。n)稀釋法,特點(diǎn)(t232。diǎn)： 不需任何特殊設(shè)備 克隆出現(xiàn)效率高 實(shí)驗(yàn)室常用方法 方法： 細(xì)胞懸液通過系列稀釋 每個(gè)培養(yǎng)孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞,第六十一頁，共一百二十三頁。,FACS：效率(xi224。o lǜ)最高價(jià)格昂貴,第六十二頁，共一百二十三頁。,有限稀釋法 (1)含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板。 (2)陽性(y225。ngx236。ng)克隆稀釋成50、5細(xì)胞/ml。 例：假定細(xì)胞濃度為3.5╳ 10 5細(xì)胞/ml 0.1ml+培基3.4ml→ 10 4細(xì)胞/ml …A A0.1ml+培基9.9ml → 10 2細(xì)胞/ml …B B1.0ml+培基1.0ml → 50細(xì)胞/ml …C C1.0ml+培基9.0ml → 10細(xì)胞/ml …D D2.0ml+培基2.0ml → 5細(xì)胞/ml …E,第六十三頁，共一百二十三頁。,(3)每35天換培基一次。換培基前，先觀察每孔中有無細(xì)胞“集落”？是一個(gè)還是多個(gè)？作出標(biāo)記。 (4)79天后，細(xì)胞克隆長至孔底的1/31/2時(shí)，取上清進(jìn)行篩選，檢測有無特異性抗體存在(cnz224。i)。 (5)陽性孔轉(zhuǎn)種24孔細(xì)胞板擴(kuò)增，及時(shí)檢測、做第二次有限稀釋、凍存。,第六十四頁，共一百二十三頁。,8.凍存和復(fù)蘇(f249。 sū),1.凍存 （1）目的：保證細(xì)胞(x236。bāo)不致因傳代污染而丟失 避免多次傳代發(fā)生變異丟失染色體 防止非分泌細(xì)胞的過度生長 防止細(xì)胞密度過高而死亡,第六十五頁，共一百二十三頁。,（2）方法：液氮保存（196℃ ） 配制(p232。izh236。)方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml) + 細(xì)胞凍存 液(30%～ 40% 牛血清，50%～60% RPMI 1640培養(yǎng)液，10%DMSO ) 分裝 “慢凍”：分步冷凍，30℃→70℃→液氮 2.復(fù)蘇 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、 復(fù)蘇,第六十六頁，共一百二十三頁。,9.污染(wūrǎn)和控制,污染的微生物主要有： 細(xì)菌、酵母菌、霉菌、支原體等。 預(yù)防：(1)培基中加適當(dāng)濃度的抗生素。 (2)器皿消毒徹底，無菌操作(cāozu242。)嚴(yán)格。 (3)環(huán)境減少空氣對(duì)流。 處理：對(duì)重要的雜交瘤細(xì)胞污染后的挽救。,第六十七頁，共一百二十三頁。,10.單抗的制備(zh236。b232。i),(1)決定抗體產(chǎn)生的因素 Y=A? C? V 每個(gè)細(xì)胞的抗體產(chǎn)量(chǎnli224。ng)A 一般：75600個(gè)抗體分子/細(xì)胞/秒 鼠鼠：50ug/ml 人鼠：525ug/ml 人人：0.2510ug/ml 產(chǎn)生抗體的細(xì)胞濃度C 取決于總的細(xì)胞濃度及分泌抗體細(xì)胞的%。,第六十八頁，共一百二十三頁。,（2）體內(nèi)產(chǎn)生單抗 A. 小鼠預(yù)處理： 石蠟油、降植烷等，腹腔(f249。qiāng)注射。 B. 攻瘤： 預(yù)處理1周2月內(nèi)，用雜交瘤細(xì)胞攻擊。 5╳10 5 10 6/ 只。 C. 采集腹水： 710天，小鼠腹部脹大，用注射器抽取腹水， 58ml/次，離心取上清，分裝保存。,第六十九頁，共一百二十三頁。,腹腔(f249。qiāng)注射法,第七十頁，共一百二十三頁。,（3）體外產(chǎn)生單抗 A.含血清培養(yǎng)法 a. 靜止培養(yǎng)法：1050ug/ml b. 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法：100ug/ml c. 中空纖維：5mg/ml B.無血清培養(yǎng)法 優(yōu)點(diǎn)：節(jié)約血清、不要純化、減少過敏反應(yīng)。 成分：基礎(chǔ)培基（DMEM/RPMI1640） 血清替代(t236。d224。i)因子（激素、生長因子，結(jié) 合蛋白，貼壁因子，微量元素等）,第七十一頁，共一百二十三頁。,(4) 新培養(yǎng)方法 A. 牛淋巴液體外循環(huán)培養(yǎng)法 B. 微囊培養(yǎng)法 C. DNA重組(zh242。nɡ zǔ)的細(xì)菌發(fā)酵法,第七十二頁，共一百二十三頁。,11.單抗的特性(t232。x236。ng)和純化,(1)理化性質(zhì) 單抗IgG 多抗IgG 56℃ 30min 完全失活 有活性 63℃ 1hr內(nèi) 10min內(nèi)聚合 不被PEG沉淀 30min沉淀 pH pH68穩(wěn)定(wěnd236。ng) pH610穩(wěn)定 pH8不穩(wěn)定 IEF電泳分析 三條區(qū)帶 20+條,第七十三頁，共一百二十三頁。,(2) 優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn)：（1）特異性高 （2）均一性 （3）可重復(fù)性 （4）永生性 （5）效價(jià)高 缺點(diǎn)：（1）太單一，對(duì)熱、pH不穩(wěn)定 （2）半衰期較短 （3）可能含有病毒,第七十四頁，共一百二十三頁。,(3)純化 單抗的純花取決于實(shí)際應(yīng)用(y236。ngy242。ng)的要求和單抗的類型。 1.初步：硫酸銨沉淀法 2.IgG：正辛酸法、SPA親和