微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)總結(jié)大全(編輯修改稿)
2024-10-29 04:15 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colonyforming units，cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。（三）器材1．菌種 大腸桿菌菌懸液。2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。3．儀器或其他用具lm1無(wú)菌吸管，無(wú)菌平皿，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。（四）操作步驟l．編號(hào)取無(wú)菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明1010106。(稀釋度)各3套。，依次標(biāo)是1010101010106。2．稀釋用lmL無(wú)菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測(cè)樣品)，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。OptionsEmail Replies將101試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來(lái)回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時(shí)不要太猛太快，吸時(shí)吸管伸人管底，吹時(shí)離開(kāi)液面，以免將吸管中的過(guò)濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取101菌液lmL，此即為100倍稀釋?！溆嘁来晤?lèi)推，整個(gè)過(guò)程如圖153所示。放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。3，取樣用三支1mL無(wú)菌吸管分別吸取10105和106。的稀釋菌懸液各lmL，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌平皿中。，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復(fù)平板間的操作誤差。圖15—3平板菌落計(jì)數(shù)操作步驟4．倒平板．盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或?yàn)R到平皿蓋上。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長(zhǎng)成的菌落連在一起，影響計(jì)數(shù)。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5．計(jì)數(shù)培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)5一般選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30~300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)對(duì)照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗(yàn)不精確。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)對(duì)照平板不能少于三個(gè)，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。由1010106三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。平板菌落計(jì)數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺(tái)上適當(dāng)吹干，然后用無(wú)菌吸管吸取稀釋好的菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的平板上，并盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。，如果過(guò)少菌液不易涂布開(kāi)，過(guò)多則在涂布完后或在培養(yǎng)時(shí)菌液仍會(huì)在平板表面流動(dòng)，不易形成單菌落。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．結(jié)果2．將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入下表稀釋度104105106Cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均每毫升中的cfu2．思考題(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?(2)要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵?為什么?(3)試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡下直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用。(4)當(dāng)你的平板上長(zhǎng)出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時(shí)，你認(rèn)為問(wèn)題出在哪里?(5)用倒平板法和涂布法計(jì)數(shù)，其平板上長(zhǎng)出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間(48h)后觀察結(jié)果?三 光電比濁計(jì)數(shù)法一、目的要求1．了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理。2．學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計(jì)數(shù)法的操作方法。二、基本原理當(dāng)光線通過(guò)微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過(guò)量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測(cè)出(圖154)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測(cè)定光密度，作出光密度—菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，以樣品液所測(cè)得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，菌體計(jì)數(shù)可采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，平板菌落計(jì)數(shù)或細(xì)胞干重測(cè)定等方法。本實(shí)驗(yàn)采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。光電比濁計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、迅速，可以連續(xù)測(cè)定，適合于自動(dòng)控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細(xì)胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長(zhǎng)等因素的影響。因此，對(duì)于不同微生物的菌懸液進(jìn)行光電比濁計(jì)數(shù)應(yīng)采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過(guò)最大吸收波長(zhǎng)以及穩(wěn)定性試驗(yàn)來(lái)確定。另外，對(duì)
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