【文章內(nèi)容簡介】 持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。完成操作及每天工作后都必須對實(shí)驗室臺面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測定。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。目前國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCRELISA方法，也有膜上探針雜交方法。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCRELISA方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實(shí)驗室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實(shí)驗人員的安全防護(hù)。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。二、臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室質(zhì)量保證臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室質(zhì)量保證涉及到整個基因擴(kuò)增檢驗的所有階段，即測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報告等。(一)標(biāo)本的采集常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。臨床用于RNA(如HCV RNA)擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內(nèi)分離血清。(二)標(biāo)本的穩(wěn)定化處理用于DNA擴(kuò)增檢測的標(biāo)本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時送至實(shí)驗室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標(biāo)本有時必須進(jìn)行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測定方法來評價。(三)標(biāo)本的運(yùn)送標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗室。經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過郵寄運(yùn)送。如用于DNA擴(kuò)增檢測的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA擴(kuò)增檢測的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。通常在運(yùn)送時，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。(四)標(biāo)本的貯存臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris1 mmol/L EDTA緩沖液(pH )中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在20℃即可。用GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天。(五)標(biāo)本的處理(核酸提取)標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對其進(jìn)行充分評價以驗證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標(biāo)本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質(zhì)對其后的Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測定。當(dāng)標(biāo)本為痰時，則必須先進(jìn)行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時不能加熱，液化時間不能過長。此外，當(dāng)靶核酸為RNA時，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定失敗的常見原因是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實(shí)驗室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。對于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。(六)靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴(kuò)增靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的第一個酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈，為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯誤等；(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。核酸的擴(kuò)增有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg++濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。(七)污染在實(shí)際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴(kuò)增片段的污染(產(chǎn)物污染)；天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標(biāo)本間交叉污染(如氣溶膠從一個陽性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本)。臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室中污染的最主要來源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實(shí)驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止，并且實(shí)驗結(jié)果必須作廢。測定分析前的污染源測定分析前實(shí)驗材料的污染主要來自非病人標(biāo)本來源的核酸。測定分析階段的污染源通常，測定分析階段的每一步都可能發(fā)生對樣本的污染。反應(yīng)混合液的任何成分及核酸的制備和反應(yīng)建立階段所涉及到的實(shí)驗設(shè)備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應(yīng)管，吸頭)和實(shí)驗設(shè)備(如加樣器、離心機(jī))等。在前面三個工作區(qū)中，不當(dāng)?shù)膶?shí)驗操作會引起所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒炘O(shè)備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測時，非常容易引起污染，因此必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，并嚴(yán)格執(zhí)行。污染的避免要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染，前面所述對工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的即是為了預(yù)防污染。為避免以前測定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP，使得產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破壞來自以前測定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對以后要進(jìn)行的擴(kuò)增測定的污染。另外一種方法是持續(xù)的長波紫外燈照射，通過異補(bǔ)骨脂素光化學(xué)產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對擴(kuò)增沒有反應(yīng)但又不妨礙PCR后雜交過程，所以這種方法也能防止污染。上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其來替代嚴(yán)格的實(shí)驗室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴(kuò)增的天然DNA的污染。去除污染的措施工作完后必須定期對實(shí)驗室采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達(dá)到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面；(2)試驗后長時間的紫外照射實(shí)驗操作臺面和其他表面；(3)實(shí)驗設(shè)備如加樣器的高壓消毒。(八)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗項目基本上都使用探針雜交方法。雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標(biāo)記方法不對、對探針的標(biāo)記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉(zhuǎn)錄的反義RNA探針。探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。在擴(kuò)增后的雜交檢測中, 應(yīng)該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會降低雜交的嚴(yán)格性，還會給檢測信號的特異性帶來負(fù)面影響。相反，提高溫度和/或降低離子強(qiáng)度會增加雜交的嚴(yán)格性。因此，嚴(yán)密控制溫度和試劑的離子強(qiáng)度是避免假陽性和假陰性結(jié)果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時改變。(九)質(zhì)量控制質(zhì)量控制包括兩個方面，即室內(nèi)質(zhì)量控制(以下簡稱質(zhì)控)和室間質(zhì)量評價。室內(nèi)質(zhì)量控制必須對DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由于核酸擴(kuò)增測定的高敏感性，所以標(biāo)本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施。(1)標(biāo)本制備：常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為3040kb。明顯出現(xiàn)降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內(nèi))在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強(qiáng)的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶(如EcoRI)消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M(jìn)行質(zhì)控(在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切)。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/~。否則,殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結(jié)論。最快的對總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點(diǎn)跟DNA分離相同。但如果對結(jié)果有疑問,就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下,三種主要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現(xiàn)的帶相對較窄。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對RNA制備的質(zhì)量評價的實(shí)驗室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨(dú)的光度計比色方法也不能對RNA的完整性下結(jié)論。對于血清（漿）中病毒的測定，則要評價標(biāo)本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽情況下標(biāo)本處理方法對擴(kuò)增檢測的影響，避免由于標(biāo)本處理方法的不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，