目的基因的pcr擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定分析報(bào)告(編輯修改稿)
2025-03-27 11:51 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 GACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTT CCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTT TGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCC GCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGG CAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT GATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGC AGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAG GAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAA GATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGG ATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCG GTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGG CATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGC TGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAA GGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAA Ezrin的編碼區(qū)序列 Ezrin蛋白含有四個(gè)功能域 名稱 起始 終點(diǎn) 功能 FERM_N 9 86 將胞漿蛋白連接到膜上 FERM_M 88 206 FERM_C 210 299 ERM 338 586 結(jié)合胞漿蛋白 目前已發(fā)現(xiàn) Ezrin在食管癌及切緣食管粘膜組織中的位臵分布有胞膜分布、胞漿分布和胞膜胞漿混合分布等三種模式。惡性程度越高的癌細(xì)胞越易具有胞漿分布模式，說明 Ezrin細(xì)胞定位的變化可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。 第二部分， PCR引物設(shè)計(jì) 引物決定了 PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和特異性。目前有多種引物設(shè)計(jì)軟件，如 primer premierOligo和北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李伍舉教授開發(fā)的 Biosun等， Inter免費(fèi)引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站有primer 3， Primerfinder等。 引物設(shè)計(jì)有以下幾個(gè)原則： （ 1）引物的特異性。引物應(yīng)根據(jù)目的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物與非靶序列之間不要超過 70％的同源性或連續(xù) 8個(gè)的堿基互補(bǔ)，減少非特異產(chǎn)物； （ 2）引物的長(zhǎng)度。一般指引物中能與模板序列互補(bǔ)結(jié)合的部分，不包括在 5‘ 端額外增加的酶切位點(diǎn)序列和其他序列。引物長(zhǎng)度以 18～ 24 bp為佳。 （ 3）引物 3’ 末端的堿基。引物 3’ 末端是延伸的始端，堿基錯(cuò)配會(huì)影響延伸效率。當(dāng)最后一個(gè)堿基是 A時(shí)，容易發(fā)生錯(cuò)配，所以引物 3’ 末端最好不要為 A； （ 4）引物的 G+C含量一般為 40％～ 60％，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)； （ 5）兩條引物不能形成穩(wěn)定的二聚體，或引物自身不能形成穩(wěn)定的二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這些都會(huì)影響引物與模板的結(jié)合。 （ 6）兩條引物的融解溫度 Tm值盡量不要相差太大，引物的 Tm值粗略計(jì)算公式為 Tm = 4 （G+C） +2（ A+T）； （ 7）引物的 539。端對(duì)擴(kuò)增特異性沒有影響，因此可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性，引物 5′ 端修飾包括加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素和熒光等，引物 339。端是延伸的開始，不能進(jìn)行任何修飾。 引物設(shè)計(jì)軟件 primer premier 可通過兩個(gè)方法將序列輸入軟件中 在表中粘貼序列 打開原有的序列文件 選擇序列文件所在位置 ? 在對(duì)話框中輸入待擴(kuò)增序列 ? 點(diǎn)擊左上角的 ?Primer? 按鈕 ? Hairpin: 引物自身是否會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) ? Dimer: 同一種引物是否會(huì)形成二聚體 ? False primiring: 引物在待擴(kuò)增序列中其他位臵是否有配對(duì) ? Cross Dimer: 正向與反向引物間是否會(huì)形成二聚體 引物設(shè)計(jì)界面 正向和反向引物的互換 正向和反向引物的評(píng)價(jià) 正向和反向引物的信息 每點(diǎn)擊左邊紅色的按鈕，就出現(xiàn)相應(yīng)的內(nèi)容 對(duì)正向和反向引物進(jìn)行編輯 可對(duì)引物進(jìn)行增加或減少堿基 用鍵盤輸入了 5個(gè)堿基 引物的信息 改動(dòng)后引物的信息 重新回到雙引物的界面 “Edit”－ “Copy”－ “Sense Primer” 539。 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 339。 輸出引物序列 ?了解并掌握 PCR基因擴(kuò)增的基本原理 ?熟悉 PCR基因擴(kuò)增技術(shù)的具體操作過程 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 第三部分 PCR實(shí)驗(yàn)操作 一、概述 ? PCR：使用一
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