段旭昌免疫磁珠分離技術(shù)(imb)及在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用(編輯修改稿)
2025-03-06 20:56 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 細(xì)胞表面的 Hiv1病毒 CD44H異型細(xì)胞免疫磁珠標(biāo)記細(xì)胞示意圖免疫磁珠分離細(xì)胞及病毒示意圖十二 免疫磁珠在食品安全檢測中的應(yīng)用免疫磁珠對病毒細(xì)胞具有特異選擇性，因此能用于食品有害微生物的檢測。免疫磁珠技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有檢測迅速、有選擇性分離目的微生物，有效減少背景干擾，提高了精準(zhǔn)性。同時還能捕獲受損傷靶細(xì)菌。目前，免疫磁珠技術(shù)已廣泛用于食品樣品中致病微生物的檢測。大腸桿菌 O157的檢測傳統(tǒng)分離 O157∶H7 所采用的直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時長、工作量大等缺點(diǎn)。采用免疫磁珠技術(shù)，能夠快速地從各種食品樣品中分離富集 O157∶H7 ，滿足流行病學(xué)的研究要求和提高控制力度。 現(xiàn)在這種免疫磁珠 的方法已經(jīng)被英國公共健康服務(wù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)的分離方法，我國也已將免疫磁珠法 對大腸桿菌 O157的檢測納入國家標(biāo)準(zhǔn) （ GB/T ） 和 出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) (SN/T )。已有市售的專用免疫磁珠銷售。 檢樣25g(mL)+225mL改良 EC肉湯（ mEC+n），均質(zhì) 225mL 免疫磁珠捕獲涂布 CTSMAC平板和改良 CHROMagar O157弧菌顯色瓊脂平板挑取可疑菌落 5個 ~10個，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種 TSI MUGLST 陽性? GB/T 免疫磁珠捕獲法檢測 O157∶H7程序 陰性 血清學(xué)試驗(yàn) 非 O157細(xì)菌 生化試驗(yàn) 報告↓↓↓↓↓↓↓↓36177。 1oC 18h~24h36177。 1oC36177。 1oC 18h~24h18h~24h1增菌 2免疫磁珠捕獲與分離 Eppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號，每個樣品使用 1支 Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩 E. coli O157免疫磁珠溶液后，用開蓋器打開每支 Eppendo rff管的蓋子，每管加人 20 μL E. coli 0157免疫磁珠懸液。 mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物 1 mL，加人到 Eppendorff管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩 10 s。每個樣品更換 1支加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進(jìn)行，避免交叉污染 。 具體操作 : 在 18℃ ~30℃ 環(huán)境中，將上述 Eppendorff管連同磁板架放在 Dynal MXl樣品混合器上轉(zhuǎn)動或用手輕微轉(zhuǎn) 10 min，使 E. coli O157與免疫磁珠充分接觸。 :將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在 3 min內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來，此時，在 Eppendorff管壁中間明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。 :取 1支無菌加長吸管，從免疫磁珠聚集物對側(cè)深人液面，輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過免疫磁珠聚集物時，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到Eppendorff管中，并重復(fù) 4步驟。每個樣品換用 1支無菌加長吸管。 :洗滌免疫磁珠混合物，重復(fù)上述步驟 4~ 6 和 4 ~ 5 。 :將免疫磁珠重新懸浮在 100 μL PBSTween 20洗液中。 :用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取 50 μL免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至 CTSMAC平板和改良 CHROMagar O157弧菌顯色瓊脂平板一側(cè)，再用無菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于 36℃ 士 1 0℃ 培養(yǎng) 18 24 h 。? 菌落識別 在 CTSMAC平板上，典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色 。發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色 。在改CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色一紫紅色，邊緣無色或淺灰色。初步生化試驗(yàn) : 在 CTSMAC和改良 CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板上挑取 5個 ~10個典型或可疑菌落，分別接種 TSI瓊脂，同時接種 MUGLST肉湯，于 36℃ 士1℃ 培養(yǎng) 18h~24h。必要時進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在 TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫 (H2S)。置 MUGLST肉湯管于長波紫外燈下觀察，無熒光產(chǎn)生者為陽性結(jié)果，有熒光產(chǎn)生者為陰性結(jié)果 。對分解乳糖且無熒光的菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，于 36℃ 士 1℃ 培養(yǎng) 18h~24h，并進(jìn)行鑒定。Fratamico等將兔抗 O157∶H7 多克隆抗體連接到羊抗兔IgG包被的磁珠上，從食物增菌培養(yǎng)液中分離 O157∶H7 菌株，再將帶菌的磁珠接種到培養(yǎng)基上，加入熒光素標(biāo)記的O157∶H7 抗血清，在熒光顯微鏡下觀察，此法敏感性為10cfu/mL增菌培養(yǎng)液。Decory等建立了免疫磁珠 免疫脂質(zhì)體（ IMB/IL）熒光試驗(yàn)方法，可在 8h內(nèi)快速檢測出多種液態(tài)樣品（水樣、蘋果汁、蘋果酒）中低至 1cfu/mL的 E. coli O157∶H7 ，而傳統(tǒng)微生物學(xué)方法不能從陰性樣本中區(qū)分出 E. coli O157∶H7 感染樣本。 單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測 傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測方法檢測周期長，約 5～ 14d，步驟繁瑣且靈敏度低，而 IMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于在較低的菌液濃度時也可以通過免疫磁珠的富集作用進(jìn)行檢測，縮短了檢測時間并進(jìn)一步降低了單增李斯特菌的檢測限。 2023年，我國將免疫磁珠檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法納入了出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中 (SN/T )。 檢樣 25g(mL)對 225mLFB1増菌液（ 30 ℃ 士 1℃ ， 24h士 1h） 1mL轉(zhuǎn)種 10mL FB2増菌液（ 35℃ ， 24h士 1h）通過免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌用 吸取 50uL免疫磁珠懸液劃線于 CHROMagar 顯色培養(yǎng)基，OXA/PALCAM瓊脂平板（ 35 ℃ +1 ℃ ,24
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