【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 含量范圍 (μ g/kg) 大麥 德國(guó) 1998 67 97 2527000 小麥 丹麥 1997 50 80 504550 黑麥 丹麥 1997 266 29 102124 燕麥 丹麥 1997 121 20 42350 小麥 瑞士 1997 153 34 732395 大麥 /小麥 英國(guó) 1997 240 56 5034868 綠咖啡 日本 1997 35 74 1001740 赭曲毒素 A在各種商品中的存在情況（ 2） 商 品 國(guó) 家 文獻(xiàn)發(fā)表年份 被分析的樣品數(shù) 出現(xiàn)率 （ %） 含量范圍 (μ g/kg) 綠咖啡 英國(guó) 1997 22 50 505787 可可粉 英國(guó) 1996 50 100 22537000 干果 英國(guó) 1996 48 98 60037650 酒 德國(guó) 1996 64 89 5506320 調(diào)味品/本草植物 德國(guó) 1996 317 27 67132 二 .食品質(zhì)量安全問(wèn)題中檢測(cè)技術(shù) ?分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) 基因檢測(cè) 免疫學(xué)檢測(cè) ?化學(xué)檢測(cè)技術(shù) ? 基因檢測(cè)技術(shù)： 1. PCR法 2. 分子雜交法 3. 基因芯片法 PCR的概念 PCR技術(shù)的創(chuàng)建 PCR的原理 PCR的反應(yīng)體系和方法 PCR的類(lèi)型和應(yīng)用 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ PCR： Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶 PCR技術(shù)的創(chuàng)建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）） Khorana(1971)等提出在體外經(jīng) DNA變性 ,與適當(dāng)引物雜交 ,再用 DNA聚合酶延伸 ,克隆 DNA的設(shè)想。 1983年 ,Mullis發(fā)明了 PCR技術(shù) ,使 Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。 1988年 Saiki等將耐熱 DNA聚合酶（ Taq）引入了PCR技術(shù) 1989年美國(guó)《 Science》雜志列 PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首 ,比喻 1989年為 PCR爆炸年 ,Mullis榮獲 1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 生物樣品 DNA片段 基因診斷 基因治療 基因工程產(chǎn)品 法醫(yī)學(xué)檢測(cè) 人類(lèi)學(xué)研究 …… PCR技術(shù)誕生所依賴的社會(huì)需求和研究需要 引物 引物 Mullis的構(gòu)思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定 DNA片段 1983年 94℃ 變性 5065℃ 退火 XX℃ 延伸 Taq DNA聚合酶（ thermus aquaticus) 酶活性(%) 溫度 (℃ ) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 72℃ 94℃ 55℃ PCR循環(huán) PCR技術(shù)的原理 1 PCR技術(shù)的基本原理 無(wú)細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中 ,加入適量的緩沖液 , 微量的模板 DNA,四種脫氧單核苷酸 ,耐熱性多聚酶 , 一對(duì)合成 DNA的引物 ,通過(guò) 高溫變性 、 低溫退火 和 中溫延伸 三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán) ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍 ,一般樣品是經(jīng)過(guò) 30次循環(huán) ,最終 使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍 。 擴(kuò)增了特異區(qū)段的 DNA帶 。 加熱 變 性 復(fù)性 復(fù)溫 DNA的變性和復(fù)性 加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使 DNA雙螺旋的氫鍵斷裂 ,雙鏈解離 ,形成單鏈 DNA,這稱為 DNA的變性。 解除變性的條件后 , 變性的單鏈可以重新結(jié)合起來(lái) ,形成雙鏈 ,其原有的特性和活性可以恢復(fù) ,這稱 DNA復(fù)性 , 也叫退火。 PCR擴(kuò)增原理 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 變性、退火 變性、退火 2 PCR技術(shù)的特點(diǎn) 1 ）高度的靈敏性 30輪循環(huán) 擴(kuò)增量達(dá) 230個(gè)拷貝 PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍 2 ）特異性 引物 引物 引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定 PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。 引物設(shè)計(jì)： （ 1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū) ,與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。 （ 2）引物長(zhǎng)度以 1830 bp為宜。 （ 3） 堿基盡可能隨機(jī)分布 ,G+C占 5060%。 （ 4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 （ 5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。 （ 6）引物 3’端 為 關(guān)鍵堿基 ； 5’端無(wú)嚴(yán)格限制。 3）操作簡(jiǎn)便易行 PCR擴(kuò)增法 ,只需要數(shù)小時(shí) ,就可以用電泳法檢出 1μg 基因組 DNA中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。 通常的 DNA 擴(kuò)增法是分子克隆法 , 首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體 , 然后將它導(dǎo)入細(xì)胞后進(jìn)行擴(kuò)增 ,還要用同位索探針進(jìn)行篩選 。這種方法 ,要經(jīng)過(guò) DNA內(nèi)切 、 連接 、 轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過(guò)程 ,操作復(fù)雜 ,一般需要數(shù)周時(shí)間 。 4 ）用途廣泛 生命學(xué)科 醫(yī)學(xué)工程 遺傳工程 疾病診斷 法醫(yī)學(xué) 考古學(xué) PCR的反應(yīng)體系和方法 PCR管加熱使模板變性 , 退火使引物與模板 DNA互補(bǔ) ,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫 ( 72℃ ),在 Tap多聚酶 的作用下 ,以 dNTP為原料 ,以 引物 為復(fù)制的起點(diǎn) ,合成新鏈 。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度 ,即 高溫變性 、 低溫退火和中溫延伸 三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán) ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍 ,一般樣品是經(jīng)過(guò) 30次循環(huán) ,最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍 。 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳 ,經(jīng)溴化乙錠染色 ,在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴(kuò)增特異區(qū)段的 DNA帶 。 總體積 50100 ?l Buffer 緩沖液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反應(yīng)體系 PCR技術(shù)的基本過(guò)程 (1) 模板 DNA dNTP 引物 Buffer 預(yù)變性 模板 DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 94oC5’ 2 基本過(guò)程 PCR技術(shù)的基本過(guò)程 (2) Taq 酶 模板 DNA dNTP 引物 Buffer 循環(huán)儀 94℃ 55 ℃ 72 ℃ Taq 酶 模板 DNA dNTP 引物 Buffer 72 ℃ 5～ 7 min 瓊脂糖凝膠電泳 PCR技術(shù)的基本過(guò)程 (3) 1） PCR反應(yīng)成分 （ 1） 模板 單、雙鏈 DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制劑、 DNA結(jié)合蛋白類(lèi)。 一般 100ng DNA模板 /100?L。 模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 3 PCR反應(yīng)條件 （ 2）引物濃度 ?mol/L 濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配 ,反應(yīng)特異性下降。 （ 3） Taq DNA聚合酶 （ thermus aquaticus) U/50 ?l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降 。酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 （ 4） dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 四種 dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入 ,濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與 Mg2+結(jié)合 ,使游離的 Mg2+濃度下降 ,影響 DNA聚合酶的活性。 （ 5） Mg2+ Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑。 。 Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使 Taq酶活性喪失、 PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合 ,所以反應(yīng)體系中 dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的 Mg2+濃度。 2）循環(huán)參數(shù) (1)變性 (2) 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 94oC 2030秒 (2) 退火 溫度由引物長(zhǎng)度和 GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合 。降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。 （ 3）延伸 7075℃, 一般為 72℃ 延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定 （ 4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版 DNA的濃度 一般為 2535次 次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低 錯(cuò)誤摻入率增加 經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（ 500bp以內(nèi)） 94℃ 30s 55 ℃ 45s 72 ℃ 1min 94℃ 5min 30次 72℃ 7min 42℃ forever 1）不對(duì)稱 PCR 目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的 單鏈 DNA。 方法：采用 兩種不同濃度的引物 。分別稱為限制性引物和非限制性引物 ,其最佳比例一般是∶, 關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。 用途：制備核酸序列測(cè)定的模板 制備雜交探針 基因組 DNA結(jié)構(gòu)功能的研究 PCR的類(lèi)型 高濃度引物 低濃度引物 2)反向 PCR (reverse PCR) 是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的 DNA片段對(duì)某個(gè)已知 DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 可對(duì) 未知序列 擴(kuò)增后進(jìn)行分析 ,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng) cDNA的克隆 ,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入 DNA；建立基因組步移文庫(kù) 。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 3）多重 PCR（復(fù)合 PCR） 用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。 電泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 4） LPPCR（ Labelled primers) 利用同位素、熒光素等對(duì)ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記 ,用以直觀地檢測(cè)目的基因。 特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷 可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分 病毒 1