【文章內(nèi)容簡介】 含量范圍 (μ g/kg) 大麥 德國 1998 67 97 2527000 小麥 丹麥 1997 50 80 504550 黑麥 丹麥 1997 266 29 102124 燕麥 丹麥 1997 121 20 42350 小麥 瑞士 1997 153 34 732395 大麥 /小麥 英國 1997 240 56 5034868 綠咖啡 日本 1997 35 74 1001740 赭曲毒素 A在各種商品中的存在情況（ 2） 商 品 國 家 文獻發(fā)表年份 被分析的樣品數(shù) 出現(xiàn)率 （ %） 含量范圍 (μ g/kg) 綠咖啡 英國 1997 22 50 505787 可可粉 英國 1996 50 100 22537000 干果 英國 1996 48 98 60037650 酒 德國 1996 64 89 5506320 調(diào)味品/本草植物 德國 1996 317 27 67132 二 .食品質(zhì)量安全問題中檢測技術(shù) ?分子生物學(xué)檢測技術(shù) 基因檢測 免疫學(xué)檢測 ?化學(xué)檢測技術(shù) ? 基因檢測技術(shù)： 1. PCR法 2. 分子雜交法 3. 基因芯片法 PCR的概念 PCR技術(shù)的創(chuàng)建 PCR的原理 PCR的反應(yīng)體系和方法 PCR的類型和應(yīng)用 多聚酶鏈式反應(yīng) （ PCR： Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶 PCR技術(shù)的創(chuàng)建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）） Khorana(1971)等提出在體外經(jīng) DNA變性 ,與適當引物雜交 ,再用 DNA聚合酶延伸 ,克隆 DNA的設(shè)想。 1983年 ,Mullis發(fā)明了 PCR技術(shù) ,使 Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。 1988年 Saiki等將耐熱 DNA聚合酶（ Taq）引入了PCR技術(shù) 1989年美國《 Science》雜志列 PCR 為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首 ,比喻 1989年為 PCR爆炸年 ,Mullis榮獲 1993年度諾貝爾化學(xué)獎。 生物樣品 DNA片段 基因診斷 基因治療 基因工程產(chǎn)品 法醫(yī)學(xué)檢測 人類學(xué)研究 …… PCR技術(shù)誕生所依賴的社會需求和研究需要 引物 引物 Mullis的構(gòu)思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定 DNA片段 1983年 94℃ 變性 5065℃ 退火 XX℃ 延伸 Taq DNA聚合酶（ thermus aquaticus) 酶活性(%) 溫度 (℃ ) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 72℃ 94℃ 55℃ PCR循環(huán) PCR技術(shù)的原理 1 PCR技術(shù)的基本原理 無細胞分子克隆法：在微量離心管中 ,加入適量的緩沖液 , 微量的模板 DNA,四種脫氧單核苷酸 ,耐熱性多聚酶 , 一對合成 DNA的引物 ,通過 高溫變性 、 低溫退火 和 中溫延伸 三個階段為一個循環(huán) ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍 ,一般樣品是經(jīng)過 30次循環(huán) ,最終 使基因放大了數(shù)百萬倍 。 擴增了特異區(qū)段的 DNA帶 。 加熱 變 性 復(fù)性 復(fù)溫 DNA的變性和復(fù)性 加熱或強酸、堿性作用可以使 DNA雙螺旋的氫鍵斷裂 ,雙鏈解離 ,形成單鏈 DNA,這稱為 DNA的變性。 解除變性的條件后 , 變性的單鏈可以重新結(jié)合起來 ,形成雙鏈 ,其原有的特性和活性可以恢復(fù) ,這稱 DNA復(fù)性 , 也叫退火。 PCR擴增原理 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 變性、退火 變性、退火 2 PCR技術(shù)的特點 1 ）高度的靈敏性 30輪循環(huán) 擴增量達 230個拷貝 PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍 2 ）特異性 引物 引物 引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定 PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。 引物設(shè)計： （ 1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū) ,與非擴增區(qū)無同源序列。 （ 2）引物長度以 1830 bp為宜。 （ 3） 堿基盡可能隨機分布 ,G+C占 5060%。 （ 4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。 （ 5）兩引物間避免有互補序列。 （ 6）引物 3’端 為 關(guān)鍵堿基 ； 5’端無嚴格限制。 3）操作簡便易行 PCR擴增法 ,只需要數(shù)小時 ,就可以用電泳法檢出 1μg 基因組 DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。 通常的 DNA 擴增法是分子克隆法 , 首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體 , 然后將它導(dǎo)入細胞后進行擴增 ,還要用同位索探針進行篩選 。這種方法 ,要經(jīng)過 DNA內(nèi)切 、 連接 、 轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程 ,操作復(fù)雜 ,一般需要數(shù)周時間 。 4 ）用途廣泛 生命學(xué)科 醫(yī)學(xué)工程 遺傳工程 疾病診斷 法醫(yī)學(xué) 考古學(xué) PCR的反應(yīng)體系和方法 PCR管加熱使模板變性 , 退火使引物與模板 DNA互補 ,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫 ( 72℃ ),在 Tap多聚酶 的作用下 ,以 dNTP為原料 ,以 引物 為復(fù)制的起點 ,合成新鏈 。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度 ,即 高溫變性 、 低溫退火和中溫延伸 三個階段為一個循環(huán) ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍 ,一般樣品是經(jīng)過 30次循環(huán) ,最終使基因放大了數(shù)百萬倍 。 將擴增產(chǎn)物進行電泳 ,經(jīng)溴化乙錠染色 ,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的 DNA帶 。 總體積 50100 ?l Buffer 緩沖液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反應(yīng)體系 PCR技術(shù)的基本過程 (1) 模板 DNA dNTP 引物 Buffer 預(yù)變性 模板 DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 94oC5’ 2 基本過程 PCR技術(shù)的基本過程 (2) Taq 酶 模板 DNA dNTP 引物 Buffer 循環(huán)儀 94℃ 55 ℃ 72 ℃ Taq 酶 模板 DNA dNTP 引物 Buffer 72 ℃ 5～ 7 min 瓊脂糖凝膠電泳 PCR技術(shù)的基本過程 (3) 1） PCR反應(yīng)成分 （ 1） 模板 單、雙鏈 DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制劑、 DNA結(jié)合蛋白類。 一般 100ng DNA模板 /100?L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 3 PCR反應(yīng)條件 （ 2）引物濃度 ?mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配 ,反應(yīng)特異性下降。 （ 3） Taq DNA聚合酶 （ thermus aquaticus) U/50 ?l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降 。酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 （ 4） dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種 dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入 ,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與 Mg2+結(jié)合 ,使游離的 Mg2+濃度下降 ,影響 DNA聚合酶的活性。 （ 5） Mg2+ Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑。 。 Mg2+濃度過低會使 Taq酶活性喪失、 PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負離子結(jié)合 ,所以反應(yīng)體系中 dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的 Mg2+濃度。 2）循環(huán)參數(shù) (1)變性 (2) 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 94oC 2030秒 (2) 退火 溫度由引物長度和 GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合 。降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。 （ 3）延伸 7075℃, 一般為 72℃ 延伸時間由擴增片段長度決定 （ 4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版 DNA的濃度 一般為 2535次 次數(shù)過多：擴增效率降低 錯誤摻入率增加 經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（ 500bp以內(nèi)） 94℃ 30s 55 ℃ 45s 72 ℃ 1min 94℃ 5min 30次 72℃ 7min 42℃ forever 1）不對稱 PCR 目的：擴增產(chǎn)生特異長度的 單鏈 DNA。 方法：采用 兩種不同濃度的引物 。分別稱為限制性引物和非限制性引物 ,其最佳比例一般是∶, 關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組 DNA結(jié)構(gòu)功能的研究 PCR的類型 高濃度引物 低濃度引物 2)反向 PCR (reverse PCR) 是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的 DNA片段對某個已知 DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。 可對 未知序列 擴增后進行分析 ,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長 cDNA的克隆 ,擴增基因文庫的插入 DNA；建立基因組步移文庫 。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 3）多重 PCR（復(fù)合 PCR） 用于檢測特定基因序列的存在或缺失。 電泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 4） LPPCR（ Labelled primers) 利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進行標記 ,用以直觀地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標本的基因診斷 可同時檢測多種基因成分 病毒 1