基因結構分析的基本策略分析(編輯修改稿)
2025-01-25 18:05 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 GE不需要在 RNA上加接頭，而是用oligo(dT)引物先進行第一鏈 cDNA的合成?然后通過捕獲帽結構，將含有 MmeI和另一內(nèi)切酶位點如 XmaJI的 linker加到單鏈全長 cDNA的3′末端 目 錄AAAAAAnCapmRNA反轉錄酶 Oligo (dT)15~18AAAAAAnCapTTTTTTTncDNA捕獲 5?帽結構單鏈 linker連接TTTTTTTnBiotincDNA第二鏈的合成TTTTTTTnAAAAAAnMmeIXmaJIMmeI酶切親和素20 mer用親和素 生物素，可以將 5?端片段與其他片段分離開目 錄連接第二個 linkerXbaIXmaJIXmaJI, Xbal酶切消化PCR（用 linker1和 linker2作引物）Linker 1 Linker 2純化，串聯(lián)連接，克隆20 merXmaJI和 XbaI是同尾酶：XmaJI： C^CTAGGXbaI： T^CTAGA串聯(lián)體測序分析目 錄第三節(jié) 啟動子的結構及功能分析目 錄主要內(nèi)容：一、啟動子的結構分析二、啟動子的功能分析目 錄啟動子（ promoter）?是一段能被蛋白質識別的、參與特定基因轉錄調(diào)控的 DNA序列?II型啟動子通常位于結構基因的上游?共通序列 (consensus sequence)是其特征性序列?共通序列和啟動子所處的位置是研究啟動子的重要線索目 錄+10 +20Start site10203040+1ATG3 +5Initiator 共通序列例如：?原核基因的共通序列：10區(qū)： Pribnow box（ T77A76T60A61A56T82序列）35區(qū)： T69T79G61A56C54A54 序列 ?真核基因的共通序列： 真核基因啟動子在 50區(qū)域附近（大約 5%~30%基因啟動子在 25~30區(qū)域）有 TATA box（ TATAAA序列）TATAATTTGACA目 錄一、啟動子的結構分析主要方法：?利用 PCR技術克隆啟動子?利用核酸 蛋白質相互作用方法研究啟動子?生物信息學預測啟動子目 錄（一）利用 PCR技術克隆啟動子特異性基因序列基因上游序列基因組 DNA根據(jù)基因序列合成一條反向引物正向引物用隨機引物PCR擴增隨機引物特異引物克隆及測序分析注意：?真核基因有內(nèi)含子，應該根據(jù) mRNA序列設計特異性引物?特異性引物盡可能靠近基因的 5?端1. 根據(jù)已知基因序列直接進行 PCR擴增目 錄2. 利用 TSS釣取啟動子AAAAAAnCap 5?mRNA反轉錄AAAAAAnTTTTTTncDNA插入載體，克隆擴增Cap 5?以基因特異引物與載體引物配對PCR擴增5?測序分析基因轉錄起始點序列以 TSS序列為引物，基因組序列為模板，與隨機引物配對進行 TSS上游序列的 PCR擴增目 錄3. 利用環(huán)狀 PCR釣取啟動子基因組 DNA酶切消化基因組 DNA片段直接環(huán)化連接 加上接頭后環(huán)化連接根據(jù)基因上游序列設計一對反向互補引物PCR擴增 根據(jù)接頭序列設計引物PCR擴增克隆測序分析克隆測序分析?加接頭環(huán)化 PCR不依賴特異基因序列?可用于篩選啟動子接頭目 錄（二）利用核酸 蛋白質互作方法研究啟動子?啟動子是一段能被蛋白質識別和結合的 DNA序列，因此，能夠檢測核酸 蛋白質相互作用的研究方法都可以用于啟動子的研究中 主要方法：?足跡法（酶足跡法，化學足跡法）?電泳遷移率變動實驗（ EMSA）?染色體免疫沉淀（ ChIP）目 錄1. 用足跡法研究啟動子足跡法（ Footprinting）?利用 DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質結合的 DNA區(qū)域 基本流程：DNA與蛋白質相互作用切割 DNA凝膠電泳分析電泳圖譜蛋白與未標記的競爭 DNA結合蛋白與標記的 DNA結合凝膠電泳放射自顯影目 錄（ 1）酶足跡法 (Enzymatic footprinting) 利用能切割 DNA的酶處理 DNA蛋白質混合物，然后通過電泳進行分析 ? DNase I足跡法 (DNase I footprinting) 是一種利用 DNase I 隨機切割雙鏈 DNA，從而確定 DNA結合蛋白在 DNA上結合位點的方法 ? 核酸外切酶 III足跡法 (Exonucleoase III footprinting) 是利用核酸外切酶 III（ Exo III） 的 3??5?外切酶活性從 3?末端切割雙鏈 DNA的特性，確定蛋白質在DNA上的結合位點的常用方法 目 錄DNase I 足跡法dsDNA單鏈末端標記DNA結合蛋白DNase I酶切消化（控制反應時間）產(chǎn)生長短不同的片段但蛋白質結合區(qū)被保護目 錄蛋白質結合區(qū)M Nopro ProDNA對在凝膠上出現(xiàn)空白區(qū)域的 DNA進行克隆測序，即可確定結合蛋白質的 DNA序列變性凝膠電泳目 錄（ 2）化學足跡法 (Chemical footprinting) ?是利用能切斷 DNA骨架的化學試劑處理 DNA蛋白質復合物，從而通過化學試劑無法接近結合蛋白質的 DNA區(qū)域而確定 DNA的蛋白質結合位點主要方法：?羥自由基足跡法 ?體內(nèi)足跡法目 錄1）羥自由基足跡法（ Hydroxyl radical footprinting） 化學試劑羥自由基?利用化學試劑產(chǎn)生的羥自由基攻擊 DNA分子表面脫氧核糖骨架使 DNA斷裂?當 DNA結合蛋白將脫氧核糖遮蓋時，自由羥基無法攻擊而使這個區(qū)域的 DNA受到保護 電泳圖譜上出現(xiàn)空白區(qū)的地方就是結合蛋白質的 DNA變性凝膠電泳目 錄2）體內(nèi)基足跡法（ In vivo footprinting） ?用化學試劑對活細胞進行體內(nèi)處理，使 DNA在細胞內(nèi)受到化學修飾，然后裂解細胞，用化學法或酶法進行足跡實驗。 ?甲基化干擾實驗 (Me
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