【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 判定為陽(yáng)性。（微孔法中的GEF=99+27=126） 陽(yáng)性對(duì)照參考值 ? 其一，陽(yáng)性對(duì)照組總誘導(dǎo)率IMF至少 ≥300 106，其中小克隆 IMF至少 ≥120 106 ? 其二，小克隆 IMF至少≥150 106 ? 滿足上述標(biāo)準(zhǔn)之一，并且陽(yáng)性對(duì)照相對(duì)總生長(zhǎng)率 （ RTG） ≥10% 結(jié)果評(píng)判 原標(biāo)準(zhǔn)組合中唯一一項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn) 采用大鼠或小鼠（ 6～ 10周） 分析骨髓中嗜多染紅細(xì)胞中的微核，嗜多染紅細(xì)胞是紅細(xì)胞成熟的一個(gè)階段，主核已排出，容易觀察微核 遺傳毒性試驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn) 3 4 體內(nèi)微核試驗(yàn) 微核形成 體內(nèi)微核試驗(yàn) 劑量設(shè)置 ?陰性對(duì)照組 /溶劑對(duì)照組； ?受試物至少三個(gè)劑量組； ?陽(yáng)性對(duì)照組； （ S2 R1建議無(wú)需每次試驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照） 體內(nèi)微核試驗(yàn) 試驗(yàn)方法 ?給藥－臨床擬用途徑； ?預(yù)試驗(yàn)中測(cè)定時(shí)相點(diǎn)，確定正式試驗(yàn)的采樣時(shí)間； ?收集骨髓細(xì)胞，離心，涂片，干燥，固定，染色 體內(nèi)微核試驗(yàn) 讀片 ?計(jì)數(shù) PCE/NCE的比例－反映毒性 ?計(jì)數(shù)含微核 PCE的細(xì)胞百分率； 體內(nèi)微核試驗(yàn) S2R1推薦的試驗(yàn)方法 測(cè)試系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞： CHL, CHO, V79 胞質(zhì)分裂組織劑 —— 松胞素 B（ CytB） 通過(guò)阻止微絲聚合而破壞胞質(zhì)分裂所需的微絲環(huán)，從而達(dá)到阻滯胞漿分裂又不影響胞核分裂的目的。 體外雙核微核 濃度設(shè)置 陰性對(duì)照組 /溶劑對(duì)照組； 受試物至少三個(gè)濃度組 陽(yáng)性對(duì)照組； 體外雙核微核試驗(yàn) 方法 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)； 受試物處理； 收獲細(xì)胞，滴片 空氣干燥，染色 (+CytB) (+CytB) 體外雙核微核試驗(yàn) 讀片分析 胞漿分裂阻斷增值指數(shù)（ CBPI） －細(xì)胞毒性 雙核微核率 （ 1000～ 2023個(gè)雙核） 體外雙核微核試驗(yàn) 給藥染毒 采集血樣（～ 100?l） － 80℃ 至少固定 3d 離心 (300g,10min,4℃ ) buffer洗脫 孵育標(biāo)記 FCM檢測(cè) 4℃ , 30min RT/37℃ , 30min S2R1推薦的試驗(yàn)方法 FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè) FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè) ?甲醇（ %） ?－ 80℃ ?至少固定 3d ?AntiCD71FITC ?AntiCD61PE ?PI ?RNase ?生物標(biāo)準(zhǔn)品 —伯氏瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞模仿 MN ?調(diào)節(jié) PMT電壓 ?調(diào)節(jié)補(bǔ)償 血樣固定 標(biāo)記染色 質(zhì)控 FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè) 圖 1 利用 CD71()樣品和瘧原蟲(chóng)生物標(biāo)準(zhǔn)品建立 FCM檢測(cè)小鼠外周血 MN的模板。 A B C D FCM與常規(guī)顯微鏡檢 MN結(jié)果相關(guān)性良好，同時(shí)獲得 3個(gè)指標(biāo)： %RET、 %MNRET和 %MNNCE； 染色體斷裂劑和非整倍體誘導(dǎo)劑都能檢測(cè)出來(lái)； 重復(fù)性好，同樣的受試物劑量在本實(shí)驗(yàn)室和其他已知報(bào)道的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果相當(dāng)； 排除一些假陽(yáng)性因素的干擾 : ? 使用 RNase，排除 聚集 RNA的干擾； ? 使用 CD61抗體，排除 血小板 的干擾； ? 使用 CD71抗體特異標(biāo)記 RET，排除常規(guī) Giemsa同染的 嗜堿性小體 等干擾。 三色 FCM自動(dòng)化 MN檢測(cè)系統(tǒng)符合IWGT的標(biāo)準(zhǔn) FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè) 基本滿足分子生物學(xué)和組合化學(xué)的大量候選化合物的毒性篩選 快速、高通量 靈敏、客觀 機(jī)制研究 無(wú)種屬選擇性 三色 FCM vs 顯微鏡檢 ? 既可以檢出染色體斷裂劑，也可以檢出非整倍體誘導(dǎo)劑； ? 研究量效關(guān)系和毒性閾值。 嚙齒類(lèi)骨髓和外周血；其他骨髓樣品不易獲取且脾臟亦有消除 MNRBC作用的物種的 MN檢測(cè) （狗、靈長(zhǎng)類(lèi)等） FCM亦能得出 MN大小和分布的資料，即 PI相關(guān)的熒光數(shù)值的大?。ㄈ?DNA含量） FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測(cè) S2R1推薦的試驗(yàn)方法 體內(nèi) Comet試驗(yàn) 體內(nèi) Comet 試驗(yàn) 遺傳毒性新方法的研究 體內(nèi) Piga基因突變?cè)囼?yàn) Piga是 N—乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催化亞基的編碼基因， N—乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶催化細(xì)胞表面磷脂酰肌醇聚糖（ glycosylphosphatidylinositol, GPI）錨的早期合成， GPI錨可將一些特殊的蛋白（如 CD5 CD48等）連接到細(xì)胞表面。 piga突變導(dǎo)致細(xì)胞表面 GPI錨蛋白缺陷。在與 GPI錨合成有關(guān)的基因中，只有 piga位于 X染色體上，其他基因都位于常染色體上，故 GPI錨缺陷表型幾乎等同于 piga突變。 基本原理 體內(nèi) Piga基因突變?cè)囼?yàn) 體內(nèi) Piga基因突變?cè)囼?yàn) 體內(nèi) Piga基因突變?cè)囼?yàn) 藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則 1 遺傳毒性試驗(yàn)方法的研究 2 藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要 3 傳統(tǒng)和替代致癌試驗(yàn)的研究 4 4 主要內(nèi)容 藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要 藥物致癌性試驗(yàn)的指導(dǎo)原則 2. ICH 指導(dǎo)原則 S1A：藥物致癌試驗(yàn)的必要性 S1B：藥物致癌試驗(yàn) S1C：藥物只要試驗(yàn)的劑量選擇 S1C(R)：藥物致癌試驗(yàn)劑量選擇的附件 1. SFDA指導(dǎo)原則（國(guó)食藥監(jiān)注 [2023]129號(hào)） 《 藥物致癌試驗(yàn)必要性的技術(shù)指導(dǎo)原則 》 Technical guidance on the need for carcinogenicity studies for pharmaceuticals （等同于 ICH S1A） 藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要 致癌性試驗(yàn)指南 藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要 ICH S1A 和 SFDA指導(dǎo)原則 致癌試驗(yàn)要求 持續(xù)使用 6個(gè)月以上的藥物或頻繁、周期性、間歇性使用的藥物； 如果有致癌傾向，一些短期使用藥物也要做致癌試驗(yàn)， 某些劑型或輸藥系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)藥物長(zhǎng)期暴露的 時(shí)間窗要求 批準(zhǔn)上市 之前要做致癌試驗(yàn)； 一些特殊關(guān)注的群體（如嬰幼兒）則需要在批準(zhǔn)（ IV期臨床）前做 用于嚴(yán)重甚至威脅生命的疾病的藥物可以在臨床批準(zhǔn)（ IV期臨床） 后做（沒(méi)滿意的可替代療法；特定人群如腫瘤病人較短的生存期； 視適應(yīng)癥不同等情況而定） 藥物致癌性評(píng)價(jià)的概要 以下情況不需要致癌試驗(yàn) 明確的基因型致癌物 假定此類(lèi)藥物具有跨種屬致癌性 經(jīng)眼睛用藥和皮膚用藥 藥物無(wú)明顯的結(jié)構(gòu)警示和全身暴露 藥物經(jīng)過(guò)鹽、酸或某些治療性基因改變 改變之前的試驗(yàn)數(shù)據(jù)已存在 改變后的 PK、 PD和毒性沒(méi)有明顯改變 用于治療危及生命的疾病或患者存活期較短（ ＜ 23年） 生物制劑（蛋白療法）通常不要求致癌試驗(yàn) — case by case（ ICH S6） ICH S1A 和 SFDA指導(dǎo)原則 遺傳毒性和致癌性的相關(guān)性 1. 基因型與非基因型致癌物的致癌性 2. Ames陽(yáng)性的致突變劑中， 80%具有致癌性 3. 由 2年動(dòng)物致癌試驗(yàn)證實(shí)呈陽(yáng)性的致癌物中， 50%具有遺傳毒性 Correlation is not perfect! 2. 藥物體外遺傳毒性試驗(yàn)的陽(yáng)性率偏高 (Snyder et al. –Mutat Res. 2023, 488: 15169) 25%上市藥物具有遺傳毒性結(jié)果