【正文】 判 原標(biāo)準(zhǔn)組合中唯一一項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn) 采用大鼠或小鼠（ 6～ 10周） 分析骨髓中嗜多染紅細(xì)胞中的微核，嗜多染紅細(xì)胞是紅細(xì)胞成熟的一個(gè)階段，主核已排出，容易觀察微核 遺傳毒性試驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn) 3 4 體內(nèi)微核試驗(yàn) 微核形成 體內(nèi)微核試驗(yàn) 劑量設(shè)置 ?陰性對照組 /溶劑對照組； ?受試物至少三個(gè)劑量組； ?陽性對照組； （ S2 R1建議無需每次試驗(yàn)均設(shè)陽性對照） 體內(nèi)微核試驗(yàn) 試驗(yàn)方法 ?給藥－臨床擬用途徑； ?預(yù)試驗(yàn)中測定時(shí)相點(diǎn)，確定正式試驗(yàn)的采樣時(shí)間； ?收集骨髓細(xì)胞，離心，涂片，干燥，固定，染色 體內(nèi)微核試驗(yàn) 讀片 ?計(jì)數(shù) PCE/NCE的比例－反映毒性 ?計(jì)數(shù)含微核 PCE的細(xì)胞百分率； 體內(nèi)微核試驗(yàn) S2R1推薦的試驗(yàn)方法 測試系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞： CHL, CHO, V79 胞質(zhì)分裂組織劑 —— 松胞素 B（ CytB） 通過阻止微絲聚合而破壞胞質(zhì)分裂所需的微絲環(huán)，從而達(dá)到阻滯胞漿分裂又不影響胞核分裂的目的。 A B C D FCM與常規(guī)顯微鏡檢 MN結(jié)果相關(guān)性良好，同時(shí)獲得 3個(gè)指標(biāo)： %RET、 %MNRET和 %MNNCE； 染色體斷裂劑和非整倍體誘導(dǎo)劑都能檢測出來； 重復(fù)性好，同樣的受試物劑量在本實(shí)驗(yàn)室和其他已知報(bào)道的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果相當(dāng)； 排除一些假陽性因素的干擾 : ? 使用 RNase，排除 聚集 RNA的干擾； ? 使用 CD61抗體，排除 血小板 的干擾； ? 使用 CD71抗體特異標(biāo)記 RET，排除常規(guī) Giemsa同染的 嗜堿性小體 等干擾。 嚙齒類骨髓和外周血；其他骨髓樣品不易獲取且脾臟亦有消除 MNRBC作用的物種的 MN檢測 （狗、靈長類等） FCM亦能得出 MN大小和分布的資料，即 PI相關(guān)的熒光數(shù)值的大?。ㄈ?DNA含量） FCM體內(nèi)微核自動(dòng)化檢測 S2R1推薦的試驗(yàn)方法 體內(nèi) Comet試驗(yàn) 體內(nèi) Comet 試驗(yàn) 遺傳毒性新方法的研究 體內(nèi) Piga基因突變試驗(yàn) Piga是 N—乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催化亞基的編碼基因， N—乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶催化細(xì)胞表面磷脂酰肌醇聚糖（ glycosylphosphatidylinositol, GPI）錨的早期合成， GPI錨可將一些特殊的蛋白（如 CD5 CD48等）連接到細(xì)胞表面。在與 GPI錨合成有關(guān)的基因中，只有 piga位于 X染色體上，其他基因都位于常染色體上，故 GPI錨缺陷表型幾乎等同于 piga突變。 大鼠 因?yàn)?SD大鼠的死亡率高，所以每組動(dòng)物數(shù)量要多（ 70只 /性別 /組） Wistar和 F344大鼠存活率高些，但 F344漸漸不受歡迎 Wistar大鼠用的越來越多， 50只 /性別 /組 小鼠 CD1和 B3C6F1在兩年致癌性試驗(yàn)中較常用 種屬和品系的選擇 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 1個(gè)溶劑對照組， 3個(gè)給藥組 至少 50只 /性別 /組，可考慮增加（如： 70只 /性別 /組） 中期處死 毒代樣品采集 其他血樣采集 兩年存活率低 （終身試驗(yàn)）計(jì)劃給藥 104周 理想情況下，在計(jì)劃處死時(shí)能有 25只 /性別 /組 以計(jì)劃用于臨床的給藥方式給藥；環(huán)境化學(xué)品、人用食品添加劑或動(dòng) 物飼料補(bǔ)充劑等加入飲食中。同時(shí)，需要用主實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物或獨(dú)立 的 TK組動(dòng)物進(jìn)行 TK實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評估。每周觸診 可以對腫瘤的發(fā)病提供更好的評估 對瀕死的動(dòng)物實(shí)行安樂死，早期處死要比晚期死亡更有價(jià)值 預(yù)先設(shè)定好安樂死標(biāo)準(zhǔn)將加速?zèng)Q策進(jìn)程 活體數(shù)據(jù)采集 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 每個(gè)實(shí)驗(yàn)中藥物的暴露情況都必須進(jìn)行評估 在實(shí)驗(yàn)中 第 612個(gè)月 對暴露情況評估一次就足夠了 通常取 34個(gè)時(shí)間點(diǎn) ，每個(gè)劑量組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取 34只動(dòng)物 進(jìn)行 如果用主實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物，每只大鼠取一個(gè)樣品；對于小鼠用衛(wèi)星動(dòng)物組 收集和分析對照組的樣品 期望有獨(dú)立的毒代動(dòng)力學(xué)報(bào)告 毒代動(dòng)力學(xué) 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 醫(yī)藥品通常不進(jìn)行臨床病理的檢驗(yàn)，除非有項(xiàng)目特殊要求（ STP, in press 2023） 實(shí)驗(yàn)終期進(jìn)行臨床病理檢測沒有價(jià)值，而中期處死時(shí)進(jìn)行卻很有價(jià)值 如果在實(shí)驗(yàn)早期沒有將臨床病理檢查定義好，在 15個(gè)月內(nèi)也可以考慮進(jìn)行特定的檢查 血涂片和骨髓涂片是否要進(jìn)行常規(guī)采集？ 可以作為保險(xiǎn)措施 通常不進(jìn)行 根據(jù)情況而定 臨床病理學(xué) 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 在全面評價(jià)潛在致癌性研究時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)是一個(gè)重要的工具 控制假陽性錯(cuò)誤 對罕見腫瘤 P 對常見腫瘤 P 專題負(fù)責(zé)人必須監(jiān)測活體階段所有初步假設(shè)的統(tǒng)計(jì)因素，并減少偏離 對死亡率、腫塊、大體和組織病理學(xué)數(shù)據(jù)的評估是十分復(fù)雜的 * 來自活體階段人員以及病理專家的數(shù)據(jù)要準(zhǔn)確完整 足夠的死亡率（到 80~90周時(shí)尚有 50%） 早期處死瀕死動(dòng)物以保存組織 跟蹤活體階段表明腫瘤 確定可能的死亡原因 *見指導(dǎo)原則 《 藥物慢性嚙齒類致癌試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，分析和闡釋中的統(tǒng)計(jì)學(xué) 》 , FDA CDER, 2023 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)考慮的因素 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 每層架子上的各組動(dòng)物數(shù)目相等 定期在房間內(nèi)交替架子，以減少視網(wǎng)膜退變 在非工作時(shí)間，采用低光照以減少視網(wǎng)膜退變 給藥順序：對照組，低劑量組，中劑量組，高劑量組； 避免交叉污染 以同樣順序來采集毒代樣品 高標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物管理是至關(guān)重要的 保持同樣的飼料 /墊料來源，密切監(jiān)測成分 /污染物的變化 活體期間動(dòng)物的飼養(yǎng)與管理 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 如果死亡率很高，可能一個(gè)劑量組全部早期處死更合適 FDA在通訊中提到： 在第 100周以前，幸存動(dòng)物數(shù)降至 15時(shí)，可考慮處死該給藥組或該性別所 有動(dòng)物 在某些方案中，當(dāng)幸存動(dòng)物數(shù)降至 20時(shí)，停止對高劑量組該性別動(dòng)物的 給藥；當(dāng)幸存動(dòng)物降至 15時(shí)，處死高劑量組受影響的性別的所有動(dòng)物 如果對照組的幸存動(dòng)物數(shù)下降至 20或更少時(shí)，處死所有劑量組中受影響 的性別的所有動(dòng)物 在 100周以后，如果高劑量組的幸存動(dòng)物降至 15時(shí)，處死所有劑量組中受 影響的性別的所有動(dòng)物 早期處死一個(gè)劑量組不會(huì)實(shí)驗(yàn)無效 劑量組的提前終止 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 早期處死與早期死亡 所有組織采集 早期處死動(dòng)物比發(fā)現(xiàn)死亡動(dòng)物更有價(jià)值 大鼠品系的選擇會(huì)影響動(dòng)物的壽命和到計(jì)劃處死時(shí)存活的比例 Wistar大鼠存活率比 SD大鼠高 腫塊跟蹤 跟蹤活體階段的每一個(gè)腫塊 與解剖結(jié)果的關(guān)聯(lián) 通過顯微評價(jià)來跟蹤解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的腫塊（ Peto試驗(yàn)要求） 解剖 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗(yàn) 檢查方案中各組所有動(dòng)物的所有組織和腫塊 跟蹤解剖中發(fā)現(xiàn)的所有腫塊的顯微診斷 盡可能將大體觀察與顯微觀察結(jié)果關(guān)聯(lián)起來；但是 “大體觀察與顯微觀察沒有關(guān)聯(lián)” 也是可接受的，不是每個(gè)大體觀察都有相關(guān)聯(lián)的顯微觀察，重要的是你所觀察到的。剩下的一個(gè)有功能的等位基因的突變會(huì)誘導(dǎo)腫瘤的快速發(fā) 生。 ? 歐洲認(rèn)可 Trp53+/模型來評價(jià)非遺傳毒性物質(zhì) ? rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠 攜帶一些帶有啟動(dòng)子的人類正常 ras基因插入