何水林版基因工程第五章基因的轉移與重組體的篩選和鑒定(編輯修改稿)
2024-10-08 20:33 本頁面
【文章內容簡介】 受態(tài) ” ：清洗處理 ， 在低溫下使細胞處于無離子區(qū)且有甘油或蔗糖等保護劑的懸液中 ， 保證電擊過程中細胞不被擊穿而死亡 。 轉化率： 109~1010/ ?g DNA （二） 轉 導 由噬菌體和細胞病毒介導的遺傳信息的轉移過程 （三） 轉 染 噬菌體 DNA不經(jīng)過蛋白包裝成病毒顆粒，直接被感受態(tài)細胞捕獲的過程。 與轉化無本質區(qū)別 體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。 每 ?g ?DNA能形成 106個噬菌斑 現(xiàn)在把 DNA轉移至動物細胞的過程也稱轉染 體外包裝過程 二、重組 DNA導入真核細胞 （一）導入酵母細胞 1. 原生質體轉化 2. 堿金屬離子介導的完整細胞轉化 3. PEG1000轉化法 4. 電擊法 （二）導入植物細胞 （三）導入動物細胞 1. 利用原生質體進行轉化 酵母 原生質體 感受態(tài) 酶去壁 CaCl2 PEG 插入外源基因的載體 共轉化： 將兩個以上的基因同時導入感受態(tài)細胞的方法 轉化 轉化細胞達原生質體總數(shù)的 1%~2%，轉化率受再生率影響 共轉化的原生質體占轉化子總數(shù)的 25%~33% 酵母 2. 堿金屬離子介導的完整細胞轉化 插入外源基因的載體 40% PEG 4000 熱激 涂布選擇性平板，篩選轉化子 吸收線性 DNA能力明顯大于環(huán)狀 DNA，兩者相差 80倍 轉化率： 103個 / ?g DNA； 共轉化現(xiàn)象極少 4. 電擊轉化 （ 1）適于原生質體和完整細胞 （ 2）轉化率高， 105個 / ?g DNA （ 3）單鏈轉化率高于雙鏈 3. PEG1000轉化 PEG處理酵母細胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉化 二、重組 DNA導入真核細胞 （一）導入酵母細胞 1. 載體介導的轉化（農桿菌介導） 2. DNA直接導入（基因搶法、電擊法等） 3. 種質系統(tǒng)法（花粉管通道法等） （二）導入植物細胞 （三）導入動物細胞 （二）導入植物細胞 1. 農桿菌介導的 Ti質粒遺傳轉化方法 將目的基因插入到載體的 TDNA區(qū)，形成重組DNA （二）導入植物細胞 1. 農桿菌介導的 Ti質粒遺傳轉化方法 將重組 DNA轉入含有Vir致病基因的農桿菌 （二）導入植物細胞 1. 農桿菌介導的 Ti質粒遺傳轉化方法 通過農桿菌侵染植物外植體 （二）導入植物細胞 1. 農桿菌介導的 Ti質粒遺傳轉化方法 將含有外源目的基因的 TDNA整合到植物細胞基因組中 ， 獲得轉基因植株 在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng) 2天 葉盤法的具體操作 又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將 DNA分子引入活細胞的轉化技術。 DNA ?m鎢彈頭 吸附 金屬微粒加速，進入受體細胞 基因槍 裝入 2. 基因槍法（ gene gun） 外植體制備 轟擊 外植體培養(yǎng)及選擇 具體操作 1. DNA微彈的制備 2. 外植體的制備 3. DNA微彈轟擊 4. 外植體的培養(yǎng) 植物細胞 原生質體 纖維素酶和果膠酶 DNA 混合入 電擊緩沖液 電擊處理 愈傷組織 幼苗 分化 3. 電擊法（電穿孔法） 選擇培養(yǎng) 二、重組 DNA導入真核細胞 （一）導入酵母細胞 1. 磷酸鈣沉淀法 2. 脂質體介導法 3. 顯微注射法 4. DEAE葡萄糖轉染法 （二）導入植物細胞
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